2 세대 시퀀싱 기술의 핵심 아이디어는 합성 시퀀싱입니다. 즉, 새로 합성 된 말단 라벨을 포착하여 DNA 의 서열을 결정하는 것입니다. 기존 기술 플랫폼은 주로 로씨 /454 FLX, Illumina/Solexa 게놈 분석기, 응용생물계 고체상 시스템입니다.
1 세대 시퀀싱 기술의 주요 특징은 시퀀싱의 읽기 길이가 1000bp 에 달하고 정확도가 99.999% 에 달한다는 것입니다. 그러나 시퀀싱 비용이 높고 유통량이 낮은 단점이 실제 대규모 응용에 심각한 영향을 미쳤다. 그래서 1 세대 시퀀싱 기술은 최고의 시퀀싱 방법이 아닙니다.
끊임없는 기술 발전과 보완을 거쳐 로씨의 454 기술, illumina 의 Solexa, Hiseq 기술, ABI 의 Solid 기술로 표시된 2 세대 시퀀싱 기술이 탄생했다.
2 세대 시퀀싱 기술은 시퀀싱 비용을 크게 절감하는 동시에 시퀀싱 속도를 크게 높이고 높은 정확도를 유지합니다. 이전에는 인간 게놈의 시퀀싱을 완료하는 데 3 년이 걸렸지만, 2 세대 시퀀싱 기술을 사용하는 데는 1 주만 필요했지만, 시퀀스 읽기 길이는 1 세대 시퀀싱 기술보다 훨씬 짧았다.
다음 중 하나를 수행합니다.
1) 시퀀싱 라이브러리 구축.
먼저 게놈을 준비한 다음 (염기서열회사는 샘플량이 200ng 에 이를 것을 요구하지만, Gnome 분석기 시스템에 필요한 샘플량은 100ng 까지 낮아질 수 있으며, 많은 샘플 제한 실험에 사용할 수 있음) DNA 를 무작위로 수백 개의 염기나 더 짧은 조각으로 조각화한 다음 양쪽 끝에 특수한 연결자를 넣는다. 전사 그룹 시퀀싱이라면 문고 구축이 비교적 번거롭다. RNA 조각화 후 cDNA 로 역변환한 다음 커넥터를 추가하거나 RNA 를 역방향으로 cDNA 로 변환한 다음 조각을 커넥터에 추가해야 합니다. 조각의 크기 (삽입 크기) 는 사후 데이터 분석에 영향을 주며 필요에 따라 선택할 수 있습니다. 게놈 시퀀싱의 경우 일반적으로 여러 가지 다른 크기의 삽입 조각을 선택하여 조립 과정에서 더 많은 정보를 얻습니다.
2) 표면 부착 및 브리지 확대.
Solexa 시퀀싱은 각 레인의 내부 표면에 수많은 고정 단일 체인 헤드가 있는 8 개의 레인으로 세분화된 흐름 풀이라는 유리관에서 수행됩니다. 위 단계에서 얻은 커넥터가 있는 DNA 조각을 단일 체인으로 변형한 다음 시퀀싱 채널의 커넥터 프라이머와 결합하여 후속 사전 증폭에 사용할 브리지 구조를 형성합니다.
3) 사전 증폭 (변성 및 완전 증폭)
표기되지 않은 dNTP 와 일반 Taq 효소를 추가하여 고체상교 PCR 증폭을 하고, 감지할 단일 체인 브리지 조각을 이중 체인 브리지 조각으로 증폭시킵니다. 변성을 통해 상호 보완적인 단일 체인이 풀려나 근처의 고체 표면에 고정됩니다. 끊임없는 순환을 통해 유동 풀의 고체 표면에서 수백만 개의 클러스터를 감지할 수 있는 이중 체인 조각을 얻을 수 있습니다.
4) 단일 염기 확장 및 시퀀싱.
4 개의 형광 표기된 dNTP, DNA 중합 효소 및 커넥터 프라이머를 시퀀싱된 흐름 풀에 추가하여 증폭합니다. 각 시퀀싱 클러스터가 보완 체인을 확장할 때 각 형광 마크의 dNTP 는 해당 형광을 방출할 수 있습니다. 시퀀서는 형광 신호를 포착하고 컴퓨터 소프트웨어를 통해 광신호를 시퀀싱봉으로 변환하여 테스트할 세그먼트의 시퀀스 정보를 얻습니다. 형광 신호에서 감지할 세그먼트의 시퀀스 정보를 얻는 과정을 염기 호출이라고 하며, Illumina 의 게놈 분석기 시퀀스 제어 소프트웨어와 pipeline 분석 소프트웨어에서 사용하는 소프트웨어입니다. 읽기 길이는 형광 마커의 불완전한 절단과 같이 신호 감쇄를 일으키는 많은 요소의 영향을 받습니다. 독서 길이가 늘어남에 따라 오류율도 높아진다.
5) 데이터 분석
엄밀히 말하면, 이 단계는 시퀀싱 작업 프로세스의 일부로 간주 될 수 없지만, 이 단계를 통과하는 초기 작업 만이 의미가 있습니다. 시퀀싱으로 얻은 원시 데이터는 길이가 수십 개의 염기에 불과한 서열이다. 생물 정보학 도구를 통해 이러한 짧은 서열을 겹치는 집단이나 전체 게놈의 틀로 조립하거나, 이러한 서열을 기존 게놈이나 유사한 종의 게놈 서열과 비교하고, 생물학적 의미의 결과를 얻기 위해 더 자세히 분석해야 한다. (존 F. 케네디, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 과학명언)
참고 자료:
Baidu 백과 사전-2 세대 DNA 시퀀싱 기술