DNA 시퀀싱은 인공 시퀀싱과 자동 시퀀싱으로 나눌 수 있습니다. 수작업 서열분석에는 산그 쌍탈산사슬 종료법과 무극생 조합인 길버트 화학분해법이 포함된다. 자동 시퀀싱은 실제로 DNA 서열 분석의 주류가 되었다. 미국 PE ABI 는 373, 377, 3 10, 3700 및 3 100 DNA 시퀀서를 생산했으며, 여기서 3 10 은 임상 검사 실험실에서 가장 널리 사용되는 모델입니다. 본 실험은 ABI PRISM 3 10 DNA 시퀀서의 시퀀싱 원리와 조작 절차를 소개했다.
원리 ABI PRISM 3 10 유전자 분석기 (즉, DNA 시퀀서) 는 기존의 폴리아크릴 플레이트 전기 수영 대신 모세관 전기 수영 기술을 사용하며, 회사 특허 4 색 형광 염료로 표시된 ddNTP (표시 종료자법) 를 사용하기 때문에 단일 프라이머 PCR 시퀀싱 반응을 통해 생성된 PCR 제품은 3' 입니다. 차이 1 염기, 이렇게 네 가지 형광염료의 염기서열 PCR 산물은 모세관에서 전기 수영할 수 있어 레인간 이동률 차이의 영향을 피할 수 있고, 분자 크기가 다르기 때문에 모세관 전기 영동의 유동성도 크게 높아진다. 분자가 모세관 판독 창을 통과할 때 레이저 탐지기 창의 CCD (전하 커플러) 카메라 탐지기는 형광 분자를 하나씩 감지할 수 있습니다. 여기 형광은 래스터에 의해 분할되어 서로 다른 기본 정보를 나타내는 서로 다른 색상의 형광을 구분하고 CCD 카메라에서 이미지를 동기화합니다. 분석 소프트웨어는 서로 다른 형광을 DNA 서열로 자동 변환하여 DNA 시퀀싱의 목적을 달성할 수 있다. 분석 결과는 젤 전기 영동지도, 형광 흡수봉도, 염기서열 등 다양한 형식으로 출력할 수 있다.
자동 포팅, 자동 샘플링, 자동 데이터 수집 및 분석과 같은 컴퓨터 자동 제어로 DNA 조각의 염기서열, 크기 및 정량을 측정하는 고급 정밀 기기입니다. PE 는 DNA 시퀀싱 젤 (POP 6) 과 GeneScan 젤 (POP 4) 을 포함한 젤 중합체도 제공합니다. 이 젤 알갱이들은 구멍 지름의 크기가 균일하여 젤 준비 조건이 일치하지 않아 시퀀싱의 정확성에 미치는 영향을 피한다. 주로 모세관 전기 영동 장치, Macintosh 컴퓨터, 컬러 프린터 및 전기 영동 액세서리로 구성됩니다. 컴퓨터에는 데이터 수집, 분석 및 기기 작동을 위한 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 최신 CCD 카메라 탐지기를 사용하여 DNA 시퀀싱을 2.5h 로 줄이고 PCR 세그먼트 크기 분석 및 정량 분석을 10 ~ 40 분으로 줄입니다.
기기는 DNA 시퀀싱, PCR 세그먼트 크기 분석 및 정량 분석 기능을 갖추고 있어 DNA 시퀀싱, 잡합 분석, 단일 체인 구조 다형성 분석 (SSCP), 마이크로위성 시퀀스 분석, 긴 세그먼트 PCR, RT-PCR (정량 PCR) 등의 분석을 수행할 수 있습니다. 일반적인 DNA 시퀀싱 외에도 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 유전자 돌연변이 검출, HLA 배합형 및 법의학을 수행할 수 있습니다.
시약 및 장비
1 의 주 시약. Big Dye 시퀀싱 반응 테스트 키트 BigDye Mix, 4 색 형광 마크가 포함된 ddNTP 및 PE 특허의 일반 dNTP, AmpliTaq DNA 중합 효소 FS, 반응 완충액 등.
Pgem-3zf (+) 이중 가닥 DNA 제어 템플릿 0.2g/L, 테스트 키트 지원 시약.
3.M 13 (-2 1) 인용 TGTAAAACGACGGCCAGT, 3.2μmol/L, 즉 3.2pmol/μl, 테스트 키트
4.DNA 시퀀싱 템플릿은 PCR 제품, 단일 체인 DNA 및 플라스미드 DNA 일 수 있습니다. 템플릿 농도를 조정하려면 PCR 반응 1μl 이 적당하다. 본 실험에서 측정한 플라스미드 DNA 농도는 0.2g/L, 즉 200 ng/μ L 입니다 .....
5. 프라이머는 테스트할 DNA 단편에 따라 순방향 또는 역방향 프라이머를 설계하고 3.2μmol/L, 즉 3.2 pmol/μ L 을 준비해야 합니다. 재조합 플라스미드에 공통 프라이머 시퀀스가 포함되어 있는 경우 M13 (-2/
탈 이온수 또는 삼중 증류수 소독.
7.0.2ml 또는 0.5ml PCR 덮개, PE 회사 제품에서 분리.
8.3 mol/L 아세트산 나트륨 (pH5.2) 은 40.8g NaAc·3H2O 를 70ml 증류수에 녹여 빙초산으로 pH 를 5.2 로 조절하고 100ml 로 정하여 고압 멸균 후 포장한다고 합니다.
에탄올 9.70% 와 절대 에탄올.
10. 37.5ml 의 무수에탄올과 2.5ml 3 무어/리터 초산나트륨을 혼합함으로써 NaAc 에탄올 혼합물은 실온에서 65438 0 년을 저장할 수 있다.
1 1.pop6 시퀀싱 젤 ABI 제품.
12. 템플릿 억제제 (TSR) ABI 제품