2020년 2월 6일 "Cell"에 게재된 "Co-incidence of Damage and Microbial Patterns Controls Localized Immune Responses in Roots"라는 논문을 공유하고 싶습니다. 스위스 로잔의 Zhou Feng 박사는 Wan Jianmin 교수 밑에서 공부했으며 스트리고락톤 호르몬 신호 전달을 억제하는 DWARF53 유전자를 복제했으며 그 기능도 연구했습니다. 관련 이 작품은 "Nature"에 게재되었고 현재는 풀타임으로 중국으로 돌아왔습니다. 이 글의 하이라이트는 첫째, 새로운 보고 시스템과 세포 절제 기술을 창의적으로 활용한 점이라고 생각합니다. 둘째, 단일 세포 시퀀싱을 활용하여 단일 세포 수준에서 식물 뿌리의 자연 면역 반응의 시공간적 변화를 완료할 수 있습니다. 셋째, 메커니즘이 여러 PRR로 확장됩니다. 4. 뿌리와 근권에 있는 유익한(유해한) 미생물.

기사에서는 다음 질문에 답합니다. 애기장대 뿌리 시스템은 손상 및 병원체 감염에 직면했을 때 단일 세포 수준에서 하류 면역 반응을 어떻게 활성화합니까?

식물 면역 반응에서는 병원체 관련 분자 패턴(MAMP)을 인식하는 것이 중요합니다. 이 복잡한 감지 시스템이 어떻게 미생물 군집에 지속적으로 노출되는지는 뿌리에서의 효과적인 적용에 대해 미스터리로 남아 있습니다. 애기장대 뿌리의 세포 수준에서 MAMP 수용체의 발현 패턴과 반응 수준을 관찰함으로써, 우리는 분화된 세포의 외부 층이 낮은 수준의 PRR(패턴 인식 수용체) 발현을 나타내고 하류 MAMP 반응이 부족하다는 것을 관찰했습니다. 그러나 이러한 세포는 이웃 세포의 손상을 통해 반응할 수 있습니다. 소세포 클러스터의 레이저 절제는 이웃 세포의 PRR 발현을 강력하게 상향조절할 수 있으며, 증가된 PRR 수준은 무반응 세포에서 면역 반응을 유도하기에 충분합니다. 마지막으로, 국소적인 손상은 비면역원성 유익한 박테리아에 대한 면역 반응을 일으킬 수도 있습니다. 손상 관문은 수용체 과발현에 의해 무시되어 병원체가 근권에 정착할 수 없도록 만듭니다. 우리 연구에서는 세포 손상이 국소 면역 반응을 "활성화"할 수 있다는 사실을 발견했습니다. 이는 토양의 미생물 패턴에도 불구하고 세포 손상이 어떻게 발생하는지 이해하는 데 도움이 되며 MAMP 감지에 활용될 수 있습니다.

배경을 간략하게 소개하겠습니다. 예를 들어, PTI의 특징적인 과정은 ROS의 축적, MAPK의 활성화 및 기타 마커 유전자의 발현입니다.

재료: 핵 국소화 신호에 융합된 삼중 mVENUS(NLS-3xmVENUS), 생체 내 및 세포 수준에서 MAMP 반응을 분석할 수 있는 형광 마커 재료.

MAMP 반응 마커. 유전자: 1. 초기 MAMP에 의해 유도되고 뿌리에서 고도로 발현되는 PER5(PEROXIDASE 5) 2. WRKY11(WRKY DNA-BINDING PROTEIN 11) 3. MYB51(MYB 도메인 단백질 51); - 유도된 수용체 유사 키나아제 1).

flg22 유발 MAMP 반응은 애기장대 뿌리에서 공간적으로 제한됩니다.

그림 1의 ABC에서 4개의 마커 유전자 중 뿌리를 flg22로 처리한 후 PER5 및 FRK1의 배경이 노이즈가 낮고 유도가 양호하며 MAMP 반응의 위치가 분열 영역과 신장 영역으로 제한됩니다.

분화된 뿌리 부분의 경우 고농도의 flg22로 처리하더라도 MAMP 반응 신호가 관찰되지 않았습니다. (빨간색은 PI 염색, 녹색은 형광 신호)

특정 세포 및 세포 유형의 신호를 정확하게 평가하기 위해 저자는 두 가지 마커 유전 물질을 생성했으며 다른 하나는 구성적으로 발현되고 표적화되었습니다. 멤브레인 RFP. 장기간 관찰에서 저자는 flag22로 처리한 후 분화된 뿌리가 약화되고 공간적으로 제한된 MAMP 반응을 나타냈으며 측근 형성 중에 측근 원기체 근처의 세포가 측근 원기체의 배출로 인해 어려움을 겪는다는 것을 발견했습니다. 이때 flg22를 적용하면 측근 원기체에 인접한 세포가 MAMP 처리에 강한 반응을 보인다(1D, 1F, 파란색 화살표는 측근 원기 형성 지점, 점선 원은 측근 원기 형성 지점을 나타냄) 뿌리 원기 및 흰색 화살표는 MAMP 반응을 나타냄) 그리고 자연적으로 유도되지 않은 세포 사멸(위치 1E*)이 있을 때 flg22에 의해 유도된 MAMP 반응은 이웃 세포에서 발견되며 수용체(FLS2) 의존적입니다(1G). 따라서, 분화된 뿌리는 MAMP에 반응하는 능력을 갖고 있으며, 이 반응은 고도로 국소적인 방식으로 유도됩니다(측근 원기 형성, 자발적인 세포 사멸).

레이저로 유발된 세포 절제는 뿌리에 국부적인 MAMP 반응을 일으킵니다

(F2A 흰색 별표는 레이저로 절제된 세포를 나타내며, 모두 분화된 뿌리, EP 표피, 대뇌피질, 내피에서 작동합니다. st pericycle 세포)

레이저 절제를 사용하여 다양한 유형의 뿌리 세포를 파괴한 후, 이웃 세포에서만 flg22 반응이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다. 제거된 세포 자체의 경우 MAMP 마커 유전자의 유도가 없거나 최소화되어 세포 손상 자체가 강력한 MAMP 반응을 유도하기에 충분하지 않음을 나타냅니다. 표피, 피질 및 내피가 모두 제거된 후 주엽세포는 flag22 유도에 강력하게 반응했지만 표피 세포의 제거로 인해 표피 주변 세포가 flag22(F2AB)에 반응하지 않았습니다.

우리는 토양의 유익한 미생물이 신장 구역(F1B)을 처리하기 위해 고용량(1um)의 flg22를 사용하면 이 과정을 시뮬레이션할 필요가 없다는 것을 알고 있었습니다. 응답. 복용량 효과를 배제하기 위해 우리는 세포 절제와 결합된 저용량(100nm)의 flg22가 이웃 세포에서 MAMP 반응을 유도하는지 여부를 알고 싶었습니다. 우리는 100nm flag22 처리를 적용한 후 손상되지 않은 신장 영역에서 소량의 MAMP 유도 반응(F2CD)만이 관찰되었지만 신장 영역의 표피 세포가 손상된 경우 피질 세포의 MAMP 반응이 강화되었습니다. 분화된 뿌리(F2ABCD)와 유사합니다. 따라서 저자들은 이웃 세포에서 MAMP 반응의 손상 유발 강화가 뿌리 전체에서 발생할 수 있다고 추측했습니다.

DAMP만으로는 MAMP 반응을 유도하기에 충분하지 않습니다.

이 시점에서 저자는 세포 손상으로 인해 생성된 DAMP가 이웃 세포의 MAMP 반응을 유발한 것은 아닌가 하는 의문이 들었습니다.

그래서 저자는 AtPEP1, ATP, Cellobiose, OG와 같은 몇 가지 고전적인 DAMP와 위의 4가지 DAMP의 칵테일 처리 혼합물을 선택했습니다. 각 DAMP를 flg22와 혼합한 후에는 고농도의 DAMP라도 강력하고 지속적인 flag22 반응을 유도할 수 없다는 사실이 밝혀졌습니다. [고농도(1um) flag22 처리는 세포 손상 없이 MAMP 반응을 일으키기 때문에 EZ에 형광이 나타납니다.] AtPEP1은 예외이며, 이는 PER5 반응이 아닌 DZ 영역에서 약한 FRK1 반응만 일으킬 수 있습니다. 이는 이웃 세포에 의한 손상 신호 감지가 저자가 상상한 것보다 더 복잡하고 DAMP를 통하지 않고 이온 및 삼투질의 방출 또는 기타 기계적 스트레스를 통해 이루어질 수 있음을 시사합니다.

MAMP 수용체 발현은 세포 절제에 의해 유도되며 반응을 유도하기에 충분합니다.

저자는 FLS2 과발현 물질에서 flg22 처리를 적용하면 외부 뿌리의 분화를 증가시킬 수 있음을 발견했습니다. 세포층에서는 flg22(F4A)의 반응이 관찰되었는데, 이는 세포 손상으로 인한 이웃 세포의 MAMP 반응이 PRR 발현의 증가와 관련이 있는지 여부도 암시합니다.

뿌리의 성숙 영역이든 신장 영역이든 손상(F4, BDFG)이 발생하면 FLS2의 전사 수준이 활성화되는 것을 발견했습니다. 그리고 시간과 공간에서 FLS2의 상향 조절 정도는 관찰된 MAMP(FRK1 및 PER5)의 반응 패턴과 일치합니다(F2ABCD와 F4BCDF 비교). F4E에서 우리는 FLS2의 국소 발현 수준이 세포 손상 및 flag22 적용 후에 증가한다는 것을 발견했습니다. 저자는 FLS2 활성화가 MAMP 반응과 관련이 있는지 알고 싶었고 동일한 플래그22 및 세포 손상으로 치료했을 때 인접한 MAMP 반응 세포가 FLS2 활성화 세포(F4HI)와 일치한다는 것을 발견했습니다. 이는 또한 세포 손상이 PRR의 높은 발현을 유도하고 MAMP 반응을 유도하기에 충분하다는 것을 보여줍니다.

Casparian Strips는 분화된 뿌리에서 flg22 반응을 구획화합니다.

(sgn3-3 Casparian 스트립 결실 돌연변이, 외부 물질은 직접 페리사이클 세포로 들어갈 수 있습니다. F5AB는 분화된 영역입니다 )

FLS2는 페리사이클 세포에서 높게 발현되나, sgn3-3의 성숙 영역에서는 flg22를 적용한 경우 flg22에 대한 반응이 관찰되지 않았으나, 과발현된 FLS2 물질의 경우 flg22를 적용한 경우 flg22에 대한 반응이 관찰되지 않았다. sgn3-3. flg22 반응은 야생형에서는 관찰되었지만 야생형에서는 관찰되지 않았습니다(F5AB, 빨간색 화살표는 Kjeldahl 밴드의 방해로 인해 PI로 염색될 수 없는 페리사이클 세포를 나타냄). 이 결과는 킬달 밴드가 면역 감지를 구획화할 수 있음을 보여줍니다. WT에서 FLS2의 양은 MAMP 반응을 유도할 수 없지만 강력한 프로모터는 유도할 수 있습니다(F5.AB 세 번째 열).

Suberin Lamellae는 내피에서 flg22 인식을 방해합니다.

sgn3: Kjeldahl 밴드는 신장이 시작된 후 25세포 단계에서 불연속적입니다.

esb1: Kjeldahl 밴드 신장이 시작된 후 25세포 단계에서 불연속성이 있으며, 내배엽은 미리 하위화됩니다.

ABA 처리: 내배엽은 조기 아베르화를 겪습니다.

킬달 밴드의 기능은 외부 물질이 주심세포로 들어가는 것을 방지하는 반면, 내부 마개층(2차 세포벽 변형)은 궁극적으로 전체 내배엽을 둘러싸고 내배엽에 의한 분자 흡수를 억제합니다. 소수성입니다. 내부 플러그 층은 세포벽의 분자가 내피 세포막(F5, CD)으로 들어가는 것을 허용하지 않습니다.

우리는 초기 분화된 내피 세포(신장이 시작된 후 25세포 단계, 하위화 없이)가 FLS2 과발현 물질에서 flg22에 반응을 보였지만, 후기 단계의 내피 세포(수축화되지 않은 후)를 발견했습니다. 55 세포 단계의 신장 발병), suberized) flg22에 대한 반응이 나타나지 않았습니다. (F.5E, 두 번째 열) esb1 및 ABA 처리에서는 flg22 반응이 초기 내배엽에서 억제되어 FLS2가 flg22에 결합할 수 없게 만드는 세포 보호 조기 하위화를 보여줍니다(F.5E). 이 현상(조기 내배엽 전이로 인한 FLS2 및 flg22의 분리)은 표피와 피질이 파괴되는 뿌리의 성숙 영역에서도 발생합니다(F.5F).

세포 손상은 다중 패턴 인식 수용체의 발현을 활성화시킨다

저자는 수용체의 메커니즘을 완성한 후 메커니즘을 확장하고자 했고, 그 결과 PRR, EFR, 및 3가지 유형을 발견했습니다. CERK1, RLP23 저자는 세포 손상 조건에서 이들 세 가지 수용체의 발현이 상향 조절된다는 사실을 관찰했으며, 이는 세포 손상이 MAMP에 대한 반응에서 매우 일반적인 상향 조절 반응을 매개한다는 것을 보여줍니다. (F6AB)

저자는 고전적인 LRR 도메인 수용체를 완성한 후 LORE(LIPOOLIGOSACCHARIDE-SPECIFIC REDUCED ELICITATION)와 같은 비고전적인 수용체에도 적용될 수 있는지 궁금해했습니다. 유사하게, LORE 발현은 초기 분화 세포가 파괴된 후에 강력하게 유도되었으며, LORE의 리간드 적용도 flg22(F6D )와 유사하게 성숙 영역이 아닌 신장 영역에서 MAMP 반응을 지배했습니다. 이는 이 메커니즘을 다른 PRR로 확장합니다.

뿌리-박테리아 상호 작용의 손상에 의한 면역 반응의 국소 게이팅

단지 세포학적 실험일 뿐이지만 여전히 실제로 구현해야 합니다. . 상황. 뿌리 감염을 위해 유익한 박테리아(CHA0)를 사용하여 저자는 강력한 뿌리 군집화에도 불구하고 손상되지 않은 분화된 뿌리에서 MAMP 반응이 관찰되지 않음을 관찰했습니다. 세포학적 분석과 유사하게 측면 뿌리에서 원시 MAMP 반응이 인접한 곳에서 관찰되었습니다. 염기가 형성된 세포(자발적 파괴)와 FLS2의 과발현은 MAMP 반응을 유도하기 위해 세포 손상을 필요로 하지 않았습니다(F7A). 박테리아 감염이 세포 절제와 결합되면 파괴 부위에 인접한 세포는 박테리아(F7BC)가 있는 경우 MAMP에 대한 반응을 나타냅니다.

박테리아는 다양한 리간드를 제공합니다

저자는 다음으로 근권에 유해한 박테리아인 GMI1000을 사용합니다. GMI1000의 초기 감염은 세포 손상을 일으키지 않고 강력한 MAMP 반응을 일으키지 만 계속 감염되면 표피 세포가 일부 죽습니다. , 이때 MAMP 반응의 국소적인 증가가 이웃 세포(F7D)에서 관찰될 수 있습니다. FLS2 과발현 물질의 성숙 영역에서는 flg22 처리(F4A)와 유익균 감염(F7A) 모두 MAMP 반응과 낮은 박테리아 성장(F7A, E)을 나타냈습니다. 여기서 흥미로운 점은 유해 박테리아 GMI1000의 플라젤린이 애기장대의 FLS2 수용체를 활성화할 수 없다는 것입니다.

저자가 제안한 모델 다이어그램은 F7F에서 확인할 수 있으므로 자세한 내용은 다루지 않겠습니다.

나를 위한 영감

1. 실험을 상세하게 하라. 큰 틀은 세워졌고, 성공이나 실패는 세부사항에 달려 있다.

2. 예를 들어 A=B, B=C, 그 다음 A=C와 같이 더 근사적인 동일성을 수행합니다.

3. 실험의 모든 단계는 게으르지 말고 역시 생명체는 당연하게 여겨야 합니다~