단세포 게놈학의 발전 전망은 얼마나 넓을까. 。 。 인구 정렬의 이질성은 우리가 많은 상황의 본질을 이해하는 것을 방해하여, 우리가 미세한 차이를 의식하지 못하게 하는데, 이러한 차이는 매우 중요하다. 예를 들어, 줄기세포, 종양, 노화 등 현재 가장 핫한 생물학적 문제들은 단세포 수준에서 서열을 해독했다. 사실 단세포 시퀀싱의 경우, 핵심 문제는 이 반응의 증폭과 많은 단세포 복제의 DNA 를 검출할 돈이 있는지 여부다. 시퀀싱 비용이 500 위안 이하로 떨어지면 대량의 단세포 시퀀싱반응이 꿈이 아니다. 여기서 단세포 서열분석이 미래의 이슈인 이유를 알 수 있습니다. (PS: 여기 단세포는 하나의 세포가 아니라 pg 급 DNA 와 같은 아주 적은 양의 세포 DNA 를 가리킨다.)

먼저 종양을 말하다. 종양을 철저히 치료하기 어려운 특징은 게놈의 복잡성뿐만 아니라 복잡성이 확장되는 이질성에 있다. 이질성은 실제로 종양 게놈의 복잡성으로 인한 표현형 속성이다. 이질성은 일반적으로 두 가지 상황에서 논의됩니다. 첫 번째 경우는 같은 환자의 체내 종양 세포의 이질성을 가리킨다. 종양이 발생하는 단계마다 종양 세포의 유전자 돌연변이가 다르기 때문에 각 종양 세포 집단마다 많은 하위 집단이 존재한다. 종양 세포가 전이되면, 다른 하위 집합에 속하는 종양 세포가 새로운 곳을 침범하여 새로운 종양을 형성한다. CTC (순환종양세포) 의 개념을 소개할 필요가 있습니다. 아래 그림 1 에서 볼 수 있듯이 CTC 는 종양 원대 세포가 종양 전이를 일으키는 주요 원인이라는 견해가 있다. CTC 세포는 부피가 더 크거나, "건조" 하거나, EMT (상피세포 간질) 통로에 더 쉽게 들어갈 수 있는 등 일반 종양 세포가 없는 많은 특징을 가지고 있다. 연구에 따르면 CTC 는 종양의 발전과 다음과 같은 관계가 있는 것으로 나타났다. 1 .CTC 의 수는 표기할 수 있다. 종양의 발달을 추론하다. 둘째, 혈액에 대량의 CTC 가 종양의 진행을 가속화하고 종양의 재발 시간을 줄인다. 셋째, CTC 는 임상 지표로 치료 과정을 지도할 수도 있다. 그러나, 이렇게 중요한 세포는 얻기 어렵기 때문에 연구하기가 어렵다. 왜냐하면 그것들은 혈액의 함량이 매우 적기 때문이다. 예를 들어 말기 유방암 환자 중 1.43% 만이 7.5 밀리리터의 혈액 중 500 개 이상의 CTC 를 가지고 있다. 이것은 CTC 연구회에 많은 장애물이 있다는 것을 의미한다, 왜냐하면 세포량이 너무 적기 때문이다. 두 번째 경우는 같은 환자의 다른 종양 세포가 종양의 이질성을 일으키는 것 외에도, 종양의 이질성은 다른 환자가 같은 종양을 앓을 수도 있지만,' 유사' 가 반드시 같은 것은 아니다. 다만 표형이 같다고 해서 유전자형이 같은 것은 아니다. 아래 그림 2 는 종양의 이질성 반응을 보여줍니다. 다른 색은 다른 종양 하위 집합을 나타내며, 다른 종양 하위 집합이 다른 곳을 침범하여 종양의' 진화' 의 새로운 가지 (발육으로 이해해야 함) 를 형성하여 종양의 이질성을 발생시킨다. 그리고 다른 환자로부터 얻은 종양 사이에도 이질성이 있다.

단세포 게놈 서열분석법으로 문제를 해결해야 하는 이유에 대해 논의하기 전에, 우리는 우리가 직면한 문제: 1 을 다시 한 번 정리해야 한다. 종양 게놈은 너무 복잡하고, 돌연변이가 많고, 시기마다 돌연변이가 다르고, 심각한 이질성이 있다. 많은 수의 종양 세포 게놈을 시퀀싱하는 경우 혼합 결과는 종종 판단을 방해합니다. 2. 종양 전이와 관련된 중요한 세포군 CTC 는 혈액 함량이 매우 적고 CTC 간에 이질성이 있어 대량의 CTC 세포 게놈을 얻기가 어렵고, 관련 정보를 얻더라도 문제를 설명할 수 없다.

이 두 가지 문제를 해결하기 위해 종양 환자에게 보다 정확한 맞춤형 치료를 제공하기 위해 단세포 시퀀싱이 실제로 이러한 문제를 잘 해결할 수 있다는 사실을 발견했습니다 (적어도 현재는 개념적으로).

가장 빠른 방법은 Roger Lasken 이 이끄는 연구팀은 1 세대 MDA (다중 교체 증폭) 테스트 키트 구축을 최적화했다. 이 기술은 예일 대학에서 특허를 획득한 Phi29 DNA 중합 효소를 사용했다. 이 효소는 여러 번 대체되는 특징을 가지고 있다. 반응에서 후자의 유인물의 확장은 이전에 결합된 DNA 를 능가하여 차단되지 않을 수 있다. 또한 이 효소는 길이가 10 kb 에서 50 kb 인 생성물을 연속적으로 합성할 수 있는 강력한 템플릿 DNA 결합 기능을 갖추고 있으며, 최대 100 KB 까지 합성할 수 있습니다. 3'-5' 핵산 외체효소 활성성과 자가 복구 오류 기능을 모두 갖추고 있어 충실도가 있다. 그러나 초기 게놈의 DNA 의 양이 매우 적기 때문에 일부 조각 (예: GC 함량이 적음) 이 직접 증폭되기 때문에 강한 증폭 편향이 생겨 게놈의 적용 범위를 낮출 수 있지만, MDA 법은 이 문제를 잘 해결하지 못한다. 20 12 하버드대 종신교수 셰샤오량원사는 새로운 단세포 게놈 시퀀싱 방법인 Malbac (다중 어닐링과 링 기반 증강주기) 를 개발했다. 확대 기본 설정을 크게 줄일 수 있습니다. 다음 그림과 같이 그 원리를 간단히 소개하겠습니다.

MALBAC 법의 핵심 단계: MDA 법의 효소를 계속 사용합니다 (원래의 연장 체인 대신 사용할 수 있음). 그러나 사용 된 프라이머는 게놈에서 무작위로 확장되는 미리 설계되었습니다.