기사 제목: 자가반응 선천성 T 세포 매개 암 면역 프로그램

게재 날짜 및 저널: 2022년 4월 20일 Nature 게재

Impact Factor : 2020/2021 : 49.962

주요 내용 : 마우스 유방암 모델(PyMT)에서 새로운 유형의 세포 선천성 킬러 T세포(Killer Innate-like T cell, ILTCK)가 발견되었습니다.

이 유형의 세포의 특징:

1. 전통적인 CD8 T 세포와 마찬가지로 T 세포 수용체(TCR)를 발현하지만 활성화는 수지상 세포(수지상 세포)에 의존하지 않습니다. Cell, DC), 이러한 특성은 선천성 림프 세포(Innate Lymphoid Cells)에 더 가깝습니다.

2. ILTCK는 전통적인 CD8 T 세포와 달리 PD-1 및 기타 면역억제 수용체를 발현하지 않기 때문에 세포 고갈 상태에 들어가지 않지만, 종양 세포에 대해 더욱 강력한 세포독성(세포독성)을 가지고 있습니다. .

3. 대부분의 전통적인 T 세포는 종양 신생항원을 인식하는 반면, ILTCK는 종양 고유 항원을 인식하고 상당한 조직 거주성을 가지고 있습니다.

연구 결과:

1. ILTCK에는 독특한 전사체가 있습니다

종양 침윤 T 세포 간의 이질성을 연구하기 위해 CD45+TCRβ+CD8α+를 수행했습니다. MMTV-PyMT(PyMT) 마우스 유방 종양 조직의 세포를 단일 세포 RNA 서열분석(scRNA-seq)으로 분석하고 5개의 서로 다른 클러스터를 얻었습니다. 주요 마커 유전자는 다음과 같습니다.

궤적 추론을 추가로 수행한 결과, 초기/최근 활성화된(C1) 세포와 고갈된(C2) 세포 사이에 많은 양의 혼합이 관찰되었습니다(그림 1d, e). 만성 자극에 의한 표현형 변화. 대조적으로, αβILTCKs (C3) 및 증식하는 (C5) 세포는 C1에서 추가로 분리되었습니다 (그림 1d, e). "세포 주기 효과"를 보정한 후, 최근 활성화된 αβ ILTCK로의 전환에 대한 가설 궤적은 최근 활성화된 T 세포 분화 경로와 소진된 T 세포 분화 경로와 구별되는 것으로 유지되었습니다(확장 데이터 그림 2a,b). 따라서 C1 세포는 독특한 분화 경로를 통해 C3 세포를 생성하거나 그 전구세포가 아닙니다. αβILTCK 유전자의 높은 발현을 갖는 종양 침윤성 c3-유사 CD8α T 세포 클러스터의 특징은 PyMT 유방 종양 및 마우스 전립선암 모델(확장 데이터 그림 2c-h)뿐만 아니라 인간 대장암에서도 복제되었습니다. 확장 데이터 그림 2i–k) 존재 ***는 αβILTCK 분화 프로그램이 진화적으로 보존된 종양 유발 면역 반응을 나타냄을 시사합니다.

2. ILTCKtcr은 돌연변이가 없는 종양 항원을 인식할 수 있습니다

종양 상주 NK1.1+CD8α+αβILTCK와 전통적인 PD-1+CD8α+T 세포 사이의 관계를 탐색하기 위해( PD -1+ T 세포), 각 하위 집합에서 사용되는 쌍을 이루는 TCR 시퀀스의 맵을 얻었습니다(확장 데이터 그림 3a, 보충 표 1).

그러나 상보성 결정 영역 3(CDR3) 길이는 NK1.1+αβILTCK와 PD-1+ T 세포의 TCR 간에 유사했습니다(확장 데이터 그림 3b). 특히, 우리는 NK1.1+αβILTCK 및 PD-1+ T 세포가 사용하는 TCR 쌍을 감지하지 못했는데, 이는 이들이 별개의 전구 세포에서 발생하지 않았음을 시사합니다.

각 하위 집단의 TCR의 특이성을 결정하기 위해 개선된 TCR 리포터 분석 시스템을 사용하여 원발성 PyMT 암세포에 대한 반응을 분석했습니다(그림 2b, 확장 데이터 그림 3c, 보충 표 2). 33개의 NK1.1+αβILTCK 유래 TCR 중 26개(78.8%)가 이종 암세포에 대해 상당한 반응성을 나타냈습니다(그림 2c). 이는 여러 마우스의 암세포를 인식함을 보여줍니다* **돌연변이 없는 항원을 공유함. 대조적으로, PD-1+ T 세포 유래 TCR 중 어느 것도 관련 없는 OT-ITCR에 의해 설정된 배경 수준 이상으로 반응하지 않았으며(그림 2c), 이는 개별 종양 특이적 신생항원에 반응했음을 의미합니다.

암세포에 유전자(H2-K1 및 H2-D1)를 코딩하는 고전적인 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(MHC-I) 또는 모든 MHC-I 분자의 필수 하위 단위 B2m이 부족하면 이러한 반응성은 상실됩니다. . 이는 CD8+ T 세포 대응물과 마찬가지로 αβILTCKtcr이 주로 고전적인 MHC-I로 제한된다는 것을 의미합니다.

αβILTCKTCR이 펩타이드 서열에 관계없이 MHC-I 분자를 인식하는지 여부를 테스트하기 위해 소포체 펩타이드 전달체 TAP1이 부족하여 표면 MHC-I I 수준이 사실상 감지되지 않는 PyMT 종양 유래 암 세포주를 사용했습니다. (확장 데이터 그림 4f). Siinfekl 펩타이드 안정화 MHC-I 발현은 αβILTCK TCR을 활성화하기에 충분하지 않았으며(확장 데이터 그림 4g,h), 이는 이러한 TCR이 MHC-I 분자 자체가 아닌 특정 펩타이드-MHC-I 복합체를 인식함을 나타냅니다.

3. ILTCK는 작용적으로 선택됩니다.

전통적인 CD8+T 세포가 NK1.1+αβILTCK를 생산하는지 여부를 연구하기 위해 우리는 CD8+T 세포에서 내인성 ILTCK를 재배열하여 TCR을 교체했습니다. αβILTCK 유래 TCR을 사용합니다(확장 데이터 그림 5a-e). 종양 보유 수용자 마우스로의 입양 전달 후(그림 2d), αβILTCK 유래 TCR을 발현하는 CD8+ T 세포는 PD-1 발현의 상향 조절을 보였지만 NK1.1 발현은 그렇지 않았습니다(그림 2e, f, 확장 데이터 그림 5f). 또한, 기존의 CD8+ T 세포 반응은 BATF3 및 irf8 의존성 기존 1형 수지상 세포(cDC1s)가 시작되어야 하는 반면, 종양 내 NK1.1+αβILTCK 반응은 cDC1과 독립적이었습니다(확장 데이터 그림 6). 이러한 발견은 αβILTCK가 2차 림프 기관에서 수지상 세포 매개 프라이밍과 독립적이며 기존의 CD8+ T 세포와는 별개의 존재론을 가지고 있음을 시사합니다. 실제로, 종양에서 αβILTCK 유래 TCR을 발현하는 흉선세포가 일관되고 특이적으로 NK1.1+αβILTCK를 생성하지만 PD-1+ T 세포는 생성하지 않습니다(그림 2g-i, 확장 데이터 그림 7a-c). 따라서 NK1.1+αβILTCK 및 PD-1+ T 세포는 TCR 특이성에 의존하는 방식으로 흉선세포 발달 동안 두 세포 계통 모두에서 발생할 수 있는 두 가지 상호 배타적인 세포 운명 선택을 나타냅니다.

다클론 TCR 라이브러리가 있는 흉선세포는 주로 기존의 CD4 또는 CD8 단일 양성 T 세포를 생성하는 반면(그림 3a, b), 단일클론 αβILTCKTCR을 포함하는 흉선세포는 CD4-/loCD8-/lo 세포만 생성합니다(그림 3a, b). 3a, b, 확장 데이터 그림 7d, e). 지금까지 알려진 모든 TCRαβ+ T 세포는 발생 중에 흉선에서 CD4+CD8+ 이중 양성 단계를 거칩니다. 예상한 대로, 종양 상주 NK1.1+αβILTCK 및 PD-1+ T 세포는 CD19+ B 세포가 아닌 CD4+CD8+ 흉선세포에 존재하는 Rorc-cre 대립유전자에 의해 일관되게 국소화되었습니다. 7f,g). 그러나 고도로 발현되는 전사 인자 Zbtb에 의해 구동되는 불변 자연 살해 T(iNKT) 세포와 같은 다른 선천성 T 세포와는 달리, NK1.1+ αβILTCK는 Zbtb16-cre-Rosa26LSL-YFP 대립유전자의 운명을 매핑하지 않았습니다. 데이터 그림 7h, i), 아마도 CD4+CD8+ 흉선세포를 발현하는 고전적인 MHC-I가 부족하기 때문일 수 있습니다.

양성 선택 후 CD4+CD8+ 흉선세포는 일시적으로 낮은 수준의 PD-1을 발현합니다. 대조적으로, αβILTCK-TCR을 발현하는 흉선세포는 더 높은 PD-1 발현을 유지하였고(확장 데이터 그림 7j,k), 이는 강한 TCR 자극의 이력을 나타냅니다. 실제로 33개 αβILTCK 유래 TCR 중 23개(69.7%)는 흉선 상피 세포 계통에 대해 OT-ITCR의 수준을 초과하는 수준에서 상당한 반응성을 보여 기존 CD8+ T 세포의 양성 선택을 유도했습니다(확장 데이터 그림 7l, 데이터는 표시되지 않음). 이러한 발견은 강력한 자가반응성이 iNKT 세포 및 장상피내 림프구(IEL)의 운명을 지정하는 "작용제" 선택 과정과 유사하게 αβILTCK 계통 약속을 유도한다는 것을 시사합니다.

αβILTCK 선택을 중재하는 데 있어서 조혈 간질과 방사선 저항성 간질의 역할을 구별하기 위해 우리는 야생형 또는 B2m-/- 마우스를 수용자로 사용하여 TCR-"역전사" 소세포를 생성했습니다. B2m-/- 수혜자의 흉선 αβ ILTCK 전구세포 구획은 변하지 않았지만(확장 데이터 그림 7m), 조혈 구획에서 B2m 절제에 의해 약간만 감소했고 B2m 절제에 의해 크게 감소했습니다(확장 데이터 그림 7n). 따라서 αβILTCK에 대한 작용제 선택 신호는 방사선 민감성 조혈 및 방사선 저항성 간질 구획에 의해 중복적으로 제공됩니다.

4. ILTCK는 지속적으로 종양을 다시 생성합니다

지속적으로 종양을 다시 생성합니다

αβILTCK-tcr***을 운반하는 다수의 흉선세포는 모두 PD-1과 CD122를 발현합니다( 확장 데이터 그림 7j,k)는 IEL에 위탁된 흉선 전구세포를 연상시키는 표현형입니다. 실제로 αβILTCK 종양 tcr을 발현하는 흉선 세포는 종양 내 αβILTCK 외에도 장 IEL로 분화되었으며 두 집단 모두 CD8αα 동종이 량체를 발현했습니다 (확장 데이터 그림 8a-c). 림프구 감소 종양 보유 마우스로 입양 전달된 다클론성 TCRβ+CD4-/loCD8-/loPD-1+CD122+ 흉선 전구세포는 종양 내 αβILTCK와 장내 IEL을 모두 생성했습니다(그림 3c,d, 확장 데이터 그림 8d, e). 그러나 림프구가 풍부한 마우스에서는 αβILTCK와 IEL 전구 세포가 종양에 이식되었지만 소장에는 이식되지 않았습니다 (그림 3c, d). 종양 내 αβ ILTCK 및 장내 IEL 재생의 역학을 더 자세히 조사하기 위해 우리는 Fgd5-creER-Rosa26LSL-tdTomato 대립 유전자를 사용했습니다. 여기서 타목시펜은 조혈 줄기 세포의 하위 집합을 펄스 표지하여 안정적인 자손 추적을 가능하게 했습니다(확장 데이터 그림 8f) ).

Linα-KIT+SCA1+ 골수 줄기 세포에서 20% 표지 효율로 흉선 αβ ILTCK/IEL 전구 세포의 약 3%가 운명에 국한되었으며, 이는 성체 마우스 CD4+CD8+, CD4 또는 CD8 단일 양성 및 iNKT 세포와 유사합니다. 챔버(확장 데이터 그림 8g-i). 대조적으로, 소장 CD8αα+IEL의 표지 능력은 무시할 수 있었으며(확장 데이터 그림 8k,l), 이는 조기 파종 및 현장 증식이 개체군 유지의 주요 수단임을 확인시켜 줍니다. 따라서 장내 IEL 구획이 아닌 종양 내 αβ ILTCK 구획은 흉선 전구 세포에 의해 지속적으로 보충됩니다.

5. FCER1G의 발현은 ILTCK 계통을 나타냅니다

ILTCK 계통의 특성에 대한 통찰력을 얻기 위해 종양 침윤 NK1.1+αβILTCK와 PD-1+T를 비교했습니다. 각각의 흉선 전구 세포와 세포를 비교했습니다 (확장 데이터 그림 9a). αβILTCK 전구세포에서 상향조절되었지만 성숙한 전구세포에서는 억제된 유전자는 작용제 선택 이벤트를 반영하는 Tox-Pdcd1 프로그램(확장 데이터 그림 9b, 보충 표 3)을 포함하여 항원 자극과 관련된 유전자가 풍부했습니다. αβILTCK 전구체에서 Lat 및 Cd2의 하향 조절은 TCR 신호 전달을 억제하여 성숙한 αβILTCK가 고갈에 덜 민감하게 만들 수 있습니다(확장 데이터 그림 9c, 보충 표 3). 특히, 많은 NK 수용체 및 신호 분자를 암호화하는 유전자는 αβILTCK 전구 세포에서 상향 조절되었으며(확장 데이터 그림 9d, 보충 표 3) 성숙한 NK1.1+αβILTCKs8에서는 높게 발현된 상태로 유지되었습니다. 대조적으로, Gzmc, Itga1 및 Itgae를 포함한 말단 효과기 분화 및 조직 상주 프로그램과 관련된 경로는 국소 종양 미세 환경 특정 신호에 반응하여 획득될 가능성이 높습니다(확장 데이터 그림 9e, 보충 표 3).

헌신적인 αβILTCK 전구세포의 입양 전달이 계속해서 NK1.1+αβILTCK를 생성했지만, 상당 부분은 여전히 ​​NK1.1α 세포였습니다(그림 3c). 단클론성 TCR을 발현하는 흉선세포도 NK1.1α 및 NK1.1+ 하위 집단을 발생시키기 때문에 이는 αβ ILTCK 전구체 사이에 기존 TCR 이질성의 결과일 가능성이 없습니다(그림 2g-i, 확장 데이터 그림 7b, c). ). NK1.1- 세포는 PD-1+ T 세포보다 NK1.1+αβILTCK와 전사적으로 더 유사했지만(확장 데이터 그림 9f), Pdcd1을 포함하여 흉선 αβILTCK 전구체가 풍부한 전사체의 더 높은 발현을 나타냈습니다(보충 표 4). . Gzmc를 포함한 말단 이펙터 분화와 관련된 유전자는 NK1.1 획득 시 상향 조절되었습니다(보충 표 4). 따라서 NK1.1 표지는 αβILTCK를 활성화하고 종양의 모든 αβILTCK 세포 계통을 식별하지 못할 수 있습니다.

scRNA-seq 실험은 Fcer1g가 마우스 암 모델(확장 데이터 그림 1,9g,h)에서 전사적으로 정의된 αβILTCK 클러스터(C3)에서 차별적으로 발현되고 전사적으로 존재하는 C3 하위 집단에 태그가 지정됨을 보여주었습니다. 대장암 환자의 종양 조직에서 마우스 αβ ILTCK와 유사합니다(확장 데이터 그림 2i-k, 9i). 이러한 관찰은 Fcer1g가 보존된 αβ ILTCK 계통 정의 마커일 수 있음을 시사합니다. 실제로 FCER1G 단백질은 PD-1hiCD122hi 흉선 αβILTCK 전구체에서는 상향조절되었지만 CD8 단일 양성 세포에서는 발현되지 않았으며 종양 침윤 NK1.1+αβILTCK에서는 계속 발현되었지만 PD-1+ T 세포에서는 발현되지 않았습니다(확장 데이터 그림 9j,k)는 FCER1G가 αβ ILTCK 계통에 속하는 세포를 구체적이고 안정적으로 표시함을 나타냅니다.

CD4?CD8α?TCRβ+CD1d?NK1.1? 흉선 세포에서 FCER1G+CD122+ 집단은 높은 수준의 PD-1을 발현하고 그랜자임 B(GZMB) 발현이 부족하며 이와 유사한 표현형을 갖습니다. CD122 및 PD-1***의 발현은 동일한 αβILTCK 및 IEL 전구 세포에서 발현되었습니다(그림 4a, b). 종양 침윤 T 세포 중에서 FCER1G+CD122+ 집단은 CD4α로 유지되었으며, 대부분의 상향 조절 CD8αα 동종이량체(확장 데이터 그림 9l,m)와 균일하게 PD-1 발현이 부족했습니다(그림 4a,b).

특히, FCER1G+CD122+ T 세포에는 NK1.1+GZMB+/αβILTCK와 이들의 미성숙 NK1.1γGZMBα 전구체가 모두 포함되어 있습니다(그림 4a, b). 따라서 FCER1G 발현은 활성화 상태에 관계없이 종양 침윤 αβILTCK를 완전히 식별할 수 있습니다.

대장암 환자의 경우 종양 조직에서도 FCER1G+TCRβ+ 세포가 쉽게 검출되었으며(확장 데이터 그림 9n), 이들의 *** 수용체 발현 프로파일은 마우스에서와 유사했습니다(확장 데이터 그림 9n,o). FCER1G+ T 세포는 인접한 정상 결장에 비해 종양 조직이 풍부했고(그림 4c, d), PD-1+에 비해 더 높은 수준의 GZMB를 발현했습니다(그림 4e). 종합적으로, 이러한 발견은 FCER1G를 αβILTCK 계통 정의 마커로 식별하고 αβILTCK 프로그램이 생쥐와 인간에서 진화적으로 보존된 종양 유발 면역 반응을 나타냄을 입증합니다.

6.ILTCK는 암 치료를 위해 설계될 수 있습니다

NK1.1+αβILTCK가 전염증성 사이토카인 IL-15에 결정적으로 의존한다는 이전 연구와 일관되게, 우리는 거의 FCER1G+CD122+ 흉선 αβILTCK 전구 세포의 완전한 손실이 Il15 마우스에서 관찰되었습니다(그림 5a, b). IL-15는 림프 조직과 비림프 조직 모두에서 발현되기 때문에 종양 내에서 αβ ILTCK의 확장과 활성화를 촉진하는 IL-15의 정확한 공급원은 알려져 있지 않습니다. 조혈 세포주에서 Il15의 절제는 종양 유발 αβILTCK 반응을 손상시키지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 특히 건강한 유방 조직과 비교하여 형질전환된 유방 상피 세포에서 IL-15 발현이 유의하게 증가했습니다(그림 5c). IL-15는 또한 결장암 환자의 종양 상피 세포에서 쉽게 검출 가능했으며(확장 데이터 그림 10a), PD-1+가 아닌 FCER1G+의 빈도, T 세포는 IL-15 수준과 양의 상관관계가 있었습니다(그림 5d). , 확장 데이터 그림 10a,b).

암세포에서 발현된 IL-15가 αβILTCK 반응을 조절하는지 조사하기 위해 S100a8-cre-Il15fl/flPyMT 마우스를 사용했는데, 형질전환에서는 Il15가 결실되었지만 건강한 유방 상피에는 존재하지 않았습니다. (확장 데이터 그림 10c, 데이터는 표시되지 않음)에서 삭제됩니다. 흉선 FCER1G + CD122 + αβILTCK 전구 세포의 수준은 S100a8-cre-Il15fl/flPyMT 마우스에서 유사했습니다 (그림 5e, f). 특히 대조군과 비교하여 S100a8-cre-Il15fl/flPyMT 마우스에서 종양 침윤성 αβILTCK가 유의하게 감소한 반면, 잔류 αβILTCK에서 NK1.1 및 GZMB의 발현은 유의하게 감소했습니다(그림 5e, f). 특히, S100a8-cre-Il15fl/flPyMT 마우스는 야생형 대조군에 비해 종양 성장이 가속화된 것으로 나타났습니다(그림 5g). 이러한 발견은 ILTCK가 암 면역 모니터링을 위해 암세포 유래 IL-15를 감지할 수 있음을 시사합니다.

특히, IL-15는 흉선 αβILTCK 전구 세포에서 NK1.1 및 GZMB의 상향 조절과 그에 따른 PD-1의 하향 조절을 유도하기에 충분했습니다(확장 데이터 그림 10d). 입양 전달된 αβ ILTCK 전구 세포에서 IL-15 신호 전달의 이소성 활성화가 종양 발달을 억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 타목시펜으로 처리된 Ubc-creER-Rosa26LSL-Stat5b-CA/+ 마우스로부터 흉선 αβ ILTCK 전구 세포를 정제하여 전사 인자의 발현을 유도합니다. IL-15 신호 전달 31의 전사 프로그램 다운스트림을 주로 조정하는 STAT5B(STAT5B-CA)(확장 데이터 그림 10e). 림프구가 결핍된 종양이 있는 PyMT 마우스로 입양 전달한 후, STAT5B-CA의 유도된 발현은 전달된 세포의 60배 확장과 4주 이내에 NK1.1 및 GZMB의 균일한 상향 조절을 가져왔습니다(확장 데이터 그림 10f-i) .

중요하게도, STAT5B-ca 무장 αβILTCK를 투여받은 마우스는 대조군 αβILTCK 또는 세포 전달이 없는 마우스와 비교하여 상당한 종양 성장 억제를 나타냈습니다(확장 데이터 그림 10j).

림프구가 포함된 PyMT 숙주로 입양 전달되면 STAT5B-ca 무장 αβILTCK 전구체는 종양 조직에 쉽게 정착하고 강력한 확장 및 이펙터 분화를 거쳐 종양 성장이 감소했습니다(그림 5h-j, 확장 데이터). 그림 10k). 대조적으로, 입양 전달된 STAT5B-ca 무장 흉선 CD8 단일 양성 T 세포는 종양 반응성 클론의 빈도가 낮고 종양 성장에 변화가 없을 것으로 예상되어 생착 또는 분화하지 않았습니다 (그림 5h-j). 따라서 αβILTCK의 IL-15 신호 전달 축은 암 치료제 개발을 위한 강력하고 활용 가능한 기질이 될 수 있습니다.

토론

이 연구에서 우리는 FCER1G+αβILTCK 프로그램을 독특하고 진화적으로 보존된 종양 유발 T 세포 반응으로 확립하고 암세포 소스 IL-15가 필수라는 것을 확인했습니다. 항종양 효과를 충분히 발휘할 수 있습니다. FCER1G는 여러 NK 수용체에 필요한 활성화 모티프를 제공하기 때문에 흉선 αβ ILTCK 전구 세포에서의 초기 발현은 종양 조직에서 NK 수용체 상향 조절 시 이펙터 기능의 신속한 획득을 향상시킬 수 있습니다. FCER1G는 또한 인간 종양 침윤 αβ ILTCK 유사 세포의 하위 집합을 특이적으로 표시하지만, FCER1G32는 순환하는 인간 CD8+ T 세포의 하위 집합에서 장기간 IL-15 노출에 의해 유도될 수 있습니다. 아마도 FCER1G의 발현은 마우스 αβILTCK보다 인간 αβILTCK에서 더 동적으로 조절될 수 있습니다. 또한 FCER1G는 인간 αβILTCK 외에 다른 계통을 표시할 수 있으며 이에 대한 해결 방법에 대한 추가 연구가 필요합니다. 종양 반응성 TCR의 광범위한 발현에도 불구하고 IL-15 활성화 αβ ILTCK8은 세포 독성에 필요하지 않습니다.