생물분리 공학에서 전기영동 기술의 역할

초기 전기영동 기술은 스웨덴 웁살라대학교 물리화학과 스베드베리(Svedberg) 교수가 제안했다. 전하를 띤 콜로이드 입자가 전기장에서 움직이는 현상을 전기영동이라고 불렀다.

1937년 노벨상 수상자인 아르네 티셀리우스(Arne Tiselius) 교수는 이러한 전기영동 현상을 사용하여 단백질 분리 연구를 위한 최초의 인터페이스 전기영동을 발명하여 전기영동 기술의 새로운 시대를 열었습니다.

이후 다양한 전기영동 기술과 기구가 속속 등장해 전기영동의 원리에 따라 첨단 전기영동 기기와 전기영동 기술이 생화학적 실험기술에서 중요한 위치를 차지하게 됐다. , 전기 영동에는 세 가지 형태가 있습니다. 원칙적으로 전기 영동의 원리에 따라 이동 인터페이스 전기 영동, 구역 전기 영동 및 정상 상태 전기 영동 또는 변위 (변위) 전기 영동으로 구분됩니다.

자유 이동 계면 전기영동에서는 계면의 움직임을 관찰하여 전하를 띤 분자의 이동 속도를 측정합니다.

대신 지지 매체를 이용한 구역 전기영동이 사용됩니다.

사용하는 지지체의 종류, 입자 크기, 전기영동 방법에 따라 구역 전기영동의 임상적 적용 가치도 달라집니다.

고체 지지 매체는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 하나는 여과지, 셀룰로오스 아세테이트 필름, 실리카겔, 알루미나, 셀룰로오스 등이고 다른 하나는 전분, 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔입니다.

미세한 다공성 네트워크 구조를 가지고 있기 때문에 전기 영동을 생성하는 것 외에도 분자체 효과도 있습니다. 작은 분자는 큰 분자보다 빠르게 작동하여 분해능을 향상시킵니다.

단백질을 거의 흡착하지 않아 전기영동 시 테일링(tailing)이 없다는 것이 가장 큰 장점이다.

저농도 아가로스 전기영동은 전기장 내에서 단백질이 자유롭게 침투할 수 있고, 분리가 명확하며, 투명도가 높으며, 염료에 침투할 수 있습니다. 200~7000nm의 파장을 가진 벨트의 감지 감도. 이제 첫 번째 유형의 지지 매체가 두 번째 유형의 지지 매체로 대체되었습니다.

정상 전기영동이나 변위 전기영동의 특징은 등전점 전기영동이나 등전위초영동처럼 분자입자의 전기영동 이동이 일정 시간이 지나면 정상상태에 도달한다는 점이다.

구역 전기영동은 임상검사 분야에서 가장 널리 사용되는 기술로 중요한 임상적 의의를 가지고 있으며, 특히 다른 신기술들이 적용 범위를 확대하고 검출 기술을 향상시켜 현재의 상태를 설명하고 있습니다. 개발에.

1. 전기영동 결과의 정확한 해석은 임상적 질환 판단에 도움이 됩니다.

신선한 혈청은 전기영동 후 환자의 단백질 전체를 정확하게 나타낼 수 있으며, 가장 흔한 것은 알부민입니다. 특정 글로불린 영역의 감소와 증가는 서로 다른 임상적 의미를 나타냅니다.

예를 들어, 급성 염증에서는 a1 및 a2 영역의 비율이 증가할 수 있으며, 신증후군 및 만성 사구체신염에서는 알부민이 감소하고, a2 글로불린은 증가하며, 철성 빈혈에서는 β-글로불린 결핍도 증가합니다. , 의학교육네트워크(Medical Education Network)에 따르면 트랜스페린의 증가로 인해 베타존이 증가할 수 있으며, 만성 간질환이나 간경변증의 경우 알부민의 현저한 감소와 r-글로불린의 2~3배 증가를 나타내어 면역글로불린을 나타냅니다. 다클론성 증가, β-R 융합의 가교 현상까지 볼 수 있으며, R 영역에도 얇고 조밀한 올리고클론 밴드가 존재할 수 있으며, 단일클론 혈장의 비정상적 증식으로 인해 항체 활성이 없고 균일한 면역구가 생성된다. M 단백질이라고 불리는 단백질을 검출하기 위해서는 혈청 단백질 전기영동이 선호되는 실험적 진단 방법입니다.

m 단백질 영역이라 불리는 전기영동 영역의 a2-r 영역에서 촘촘하고 깊게 염색된 고농축 단백질 클론 증식 영역을 볼 수 있는데, 이는 높고 좁은 단일 식물이다. 피크가 형성되는 경우 r 영역에 일부 피크가 있는 경우 피크 높이 대 피크 베이스 폭의 비율은 gt 2:1이며 정상적인 면역글로불린 합성의 한계로 인해 배경 염색이 약해집니다.

다발성 골수종, 거대 글로불린혈증, 중쇄 질환, 유리 경쇄 질환, 반분자 질환, 양성 단클론성 무감마글로불린혈증 및 이중 M 단백혈증 등과 같은 M 단백질로 인해 발생하는 질병 그룹은 이러한 질병에는 해당되지 않습니다. 더 이상 드물다.

혈청 단백질 전기영동은 이러한 질병의 조기 진단, 유효성 관찰 및 예후 판단에 매우 중요합니다.

2. 전기영동 기술과 면역학 기술의 결합으로 임상적용 범위가 크게 확장되었습니다

전류를 통해 항원과 항체의 확산을 가속화하고 그 진행 방향을 특정하게 함으로써 침전 반응 속도가 빨라집니다.

대류 면역 전기 영동(CIEP), 로켓 면역 전기 영동(RIE) 및 전기 면역 확산(EID)과 같은 다양한 유형의 면역 전기 영동 기술이 있습니다.

면역전기영동법을 기반으로 면역전기영동(IEP) 기술 등 몇 가지 새로운 기술이 지속적으로 도출되고 있으며, 1969년 Alper와 Johnson은 면역고정 전기영동(IFE)을 방법으로 권장했습니다. 아가로스 겔 단백질 전기영동 및 면역침강 반응의 하이브리드 기술입니다. 테스트 샘플은 혈청, 소변, 뇌척수액 또는 기타 체액일 수 있습니다.

1976년에는 M 단백질 타이핑을 위해 혈청 면역고정 전기영동(IF) 기술이 다시 권장되었습니다.

아가로스 응고배지에서 전기영동으로 혈청 단백질을 분리한 후 겔 표면의 레인에 고정액과 각종 면역글로불린, 경쇄 항혈청을 도포한 후 고정액과 항혈청을 도포한다. 겔 내로 침투 및 확산되며, 해당 원래 물질이 존재하면 적절한 위치에 항원-항체 복합체가 형성됩니다.

염색 후 단백질 전기영동 기준선과 항원-항체 침전부는 아미노블랙으로 착색되며, 전기영동 이동 거리에 따라 단일클론 성분이 분리되며, 다양한 종류의 면역글로불린과 그 경쇄를 분리할 수 있습니다. 분류되었습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 감도 50~150mg/dl, 짧은 작동 주기, 단 몇 시간, 고해상도, 결과 분석의 용이성이다.

현재 M 단백질의 분류 및 식별에 가장 일반적으로 사용되며 임상 실험실의 일상적인 테스트에 포함되었습니다.

3. 진단율 향상을 위한 동위효소 분석 전기영동 기술

1. 혈청 젖산탈수소효소 동종효소(iso-LDH): LDH 동종효소의 판별에는 전기영동, 이온교환 컬럼 크로마토그래피, 면역분석법, 억제제법, 효소소화법 등이 있으나 현재까지 가장 많이 사용되는 방법은 아가로스겔 전기영동법이다.

전기영동 분리 후 5개의 동종효소 구역을 분리해야 합니다. LDH1은 급성 심근경색 발생 후 평균 6시간 후에 증가하기 시작합니다. LDH1/LDH2 ≥ 1은 간암에서 양성 결정 수준입니다. , 각 zone의 함량을 확인하기 위해 전기영동 분리 후 동위효소 스펙트럼을 스캐닝으로 정량화한 결과, 육안으로 판단하는 것보다 정확도가 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.

2. CK 및 CH-MB를 측정하는 혈청 크레아틴 키나제 동종효소(ISO-CK)는 현재 급성 심근경색을 확인하는 데 사용되는 선택된 지표입니다.

최근 국내 일부 기관에서는 CK=MB를 측정하기 위해 면역억제법을 사용하고 있는데, 그 원리는 정상 혈청에는 CK=BB가 거의 없기 때문에 항M 서브유닛의 효소 활성을 측정하는 것입니다. 이 값은 2캔으로 CK-MB의 활동을 대략적으로 나타낸다고 볼 수 있습니다.

이 방법은 간단하고 빠르지만 특이도가 낮다는 단점이 있다. 환자의 혈청에 CK-BB가 있거나 비정상적인 CK가 있을 경우 거짓 증가가 발생하게 된다.

많은 저자들이 CK-BB와 IgG 및 IgA를 모두 포함하는 면역글로불린의 복합체인 Maxro-CK라는 비정상적인 CD 동종효소를 보고했습니다. 그 중 Marco-CK만이 설명됩니다. 0.8-1.6의 경우 다른 하나는 미토콘드리아 CK(CK-MT)라고 하며, CK-MT는 근육, 뇌 및 간에 있는 미토콘드리아 표면에 결합되어 있습니다. CK-MT MT는 나타나지 않으며, 심근경색 시에도 나타나지 않습니다. 미토콘드리아와 세포벽이 심하게 손상되어 조직이 심하게 손상된 경우에만 혈청에서 검출될 수 있습니다.

Macro-CK와 비정형 CK-MT는 모두 M 항체에 의해 억제될 수 없기 때문에 이들이 나타나면 CK의 전체 활성보다 높은 CK-MB 활성의 잘못된 증가로 이어질 것입니다.

CK-MB를 분리하기 위해 전기영동을 사용하는 것은 CK-동종효소의 다양한 분자 구조를 기반으로 하며, 이는 전기영동 완충액에서 의학 교육 네트워크에 의해 수집되고 편집되며, 이는 서로 다른 전하를 가질 수 있습니다. CK-MM, CK-MB, CK-BB의 서로 다른 성분을 분리합니다. 전기영동의 특징은 거대 CKⅠ, 거대 CKⅡ 등 2가지 동위효소가 존재할 때입니다. ., 전기 영동 패턴에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 스캐너는 각 효소 스트립을 스캔하고 전체 효소 활성과 결합하여 해당 영역의 효소 누락 결정 결과를 얻습니다.

Macro-CK는 CK-MM과 CK-MB 사이에 있고, CK-MT는 CK-MM 뒤, 음극 끝 가까이에 위치해 있습니다. 이로써 CK-BB와 각종 비정상 동위효소를 CK-MB로 오인, 오진하는 일이 발생하지 않고, CK-MB의 잘못된 증가 원인도 해결될 수 있습니다.

이러한 이유로 CK 동위효소 전기영동은 매우 실용적인 검사 기술이며 임상적으로 매우 중요한 의미를 갖습니다.

3. CK 아형 동종효소: 또한, CK-MB 및 CK-MM 아형을 판별하기 위해 아가로스겔 등전집속 전기영동이나 고전압 전기영동을 사용하는 경우가 많으며, 일반적인 전기영동에 비해 작업이 더 까다롭기 때문에, 아직은 일상적인 측정을 사용할 수 없습니다.

현재 출시된 자동 전기영동 기기에는 CK 아형 분석에 사용할 수 있는 키트가 함께 제공된다. 기준값은 CK-MM1(57.7±4.7), CK-MM2(26.5±5.3)이다. CK-MM3은 (15.8±2.5)이고, CK-MM3/CK-MM1 비율은 0.28±0.05(범위 0.15-0.39)이고 MM3은 첫 번째 혈액에서 우세합니다. AMI의 날이지만 둘째 날 이후에는 MM1이 주요 것입니다.

CKMB, CKMB1 및 CKMB2를 분리하기 위해 전기영동이 사용됩니다. 정상적인 인간 혈액에서는 CK-MB2가 매우 작으며, 일반적인 비율은 혈액에서 존재하지 않는 것과 거의 동일합니다. 급성 심근경색 후 4-6시간 동안 혈액 순환이 이루어지므로 MB2/MB1의 비율은 총 CK-MB 단편의 증가보다 먼저 크게 증가했습니다.

이 비율은 심근경색이 완화된 후에는 점차 감소합니다.

혈전용해제 치료 후 상태를 관찰하는 데에도 사용할 수 있습니다.

4. 뇌척수액에서 올리고클론 밴드를 검출하기 위해 효소 면역 표지 항체 기술과 결합

일부 저자는 CSF 단백질을 분리하고 식별하기 위해 2차원 전기 영동 및 은염색을 사용한다고 보고했습니다. 이제 고해상도 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 CSF의 단백질을 분리하고, 항원 및 고추냉이 과산화효소로 표지된 특정 IgG 항체와 반응하여 "올리고클론 밴드"(OCB)를 식별합니다. 이 효소 면역표지 증폭 기술과 발색 단계를 통해 단백질 농도가 31-125ul/L에 도달하면 검출 감도가 100배 증가할 수 있으며, 이를 통해 뇌척수액을 농축할 필요가 없습니다. 농축 과정 중 단백질 손실이 방지됩니다.

OCB 면역글로불린과 그 유형을 확인하고 구별하는 데 사용할 수 있습니다.

뇌척수액 검체에서 OCB가 검출되었으나 해당 검체에서 어떠한 영역도 검출되지 않는다면 양성으로 간주되는데, 이는 중추신경계 자체에서 합성되는 면역글로불린임을 반영하는 것이며, 중요한 임상적 의미.

다발성경화증에서 OCB는 매우 중요한 지표입니다.

그러나 다른 출처의 면역글로불린을 확인하려면 환자의 혈청과 뇌척수액을 같은 날 동시에 분석해야 합니다.

중추합성 면역글로불린은 중추신경계 질환의 중요한 신호로 다발성 경화증, 치매, 척수염, 신생물성 뇌염 등 중추신경계 질환의 감별진단에 주로 사용됩니다. 등.

5. 심장과 뇌의 독립적 위험인자를 검출하기 위해 고상항원과 항체반응을 이용하여 지단백질(a)을 분리한다.

이 기술은 항원, 항체반응을 이용한다. 전기영동으로 분리된 지질단백질을 식별합니다.

혈청을 아가로스겔 전기영동에 적용한 후 염색하면 다양한 지단백질 밴드가 나타날 수 있습니다.

겔 내 지질단백질의 등전점이 다르기 때문에 a, pre-β 및 β 영역을 구별할 수 있을 뿐만 아니라 배지에 항지단백질(a) LP(a)가 포함되어 있기 때문입니다. Anti-LP(a)는 환자의 혈청에 있는 LP(a)와 결합하여 복합체를 형성하며 양이온은 다른 지질단백질의 유영 속도를 억제하고 LP(a)는 다른 지질단백질과 분리되어 LP( a) 명확하게 구분할 수 있습니다. ) 양성 밴드를 스캔한 후 밴드가 pre-β 영역과 γ 영역 사이에 나타납니다. 이 방법을 사용하면 전기영동 기술이 더욱 완벽해지고 수동 방식의 단점이 크게 줄어듭니다. 반정량적으로 사용할 수 있으며 쉽게 비교할 수 있도록 필름을 저장할 수 있습니다.

심혈관 및 뇌혈관 질환의 독립적 위험 인자인 LP(a) 검출의 민감도와 특이도를 향상시킵니다.

6. 분자량에 따라 비농축 요단백 전기영동을 실시하여 요단백 종류를 구별합니다.

요단백 전기영동은 요단백의 종류를 구별하기 위해 소변 중의 다양한 단백질을 분리하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수술 없이 신장 손상 위치를 임상적으로 판단합니다.

국내 일부 실험실에서는 소변 단백질을 분리하기 위해 SDS-PAGE 디스크 전기영동법을 사용하지만 이 방법은 한계가 있고 시간이 많이 걸리며 조작이 번거롭고 검체 요구량이 많고 소변을 사전 농축해야 하므로 부적합합니다. 임상 실험실을 광범위하게 수행합니다.

SDS=AGE 전기영동은 사전 농축이 필요하지 않으며 소변 단백질 전기영동 후에는 주로 사구체 병변을 반영하는 중간 및 고분자량 단백질 영역을 보여줍니다. 신장 관형 병변 및 범람 단백뇨; 혼합 단백뇨에서 대형, 중형 및 소형 분자량 영역이 보일 수 있으며 이는 사구체와 신장 세뇨관이 모두 관련되어 있음을 나타냅니다.

스캐너는 전기영동 후 소변의 단백질 프로파일을 스캔하고 백분율을 계산하여 사구체 또는 신장 세뇨관 손상 정도를 표시할 수 있습니다. 전기영동 패턴 및 스캔 패턴은 영구적으로 국가 데이터로 기록될 수 있어 분석에 편리합니다. 그리고 비교.

의료교육네트워크가 수집하고 정리한 이 기술의 가장 큰 진전은 소변을 사전 농축할 필요가 없고, 조작이 간단하고, 결과가 명확하며, 단 3번만에 검사를 완료할 수 있다는 점이다. 정량화 및 분석이 용이하고 신장질환의 진단 및 감별진단, 치료 지도 및 치유 여부 판단에 유용합니다.

최근 개발된 모세관 전기영동은 새로운 형태의 구역 전기영동으로, 모세관 구역 전기영동이라고도 알려져 있습니다.

모세관에 완충용액을 넣고, 모세관 한쪽 끝에 시료를 주입한 뒤, 모세관 양쪽 끝에 DC 고전압을 인가해 시료를 분리하는 방식이다. 샘플은 모세관의 한쪽 끝에 있는 감지 장치를 차례로 통과합니다.

모세혈관 전기영동법은 검사의학에서도 널리 사용되고 있으며, 검사 시료의 출처에 따라 소변 시료, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 적혈구, 기타 체액 또는 조직으로 나눌 수 있습니다. , 살아있는 실험동물 등.

분리 대상의 관점에서 보면 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 효소, DNA, 올리고뉴클레오티드, 바이러스, 작은 생물학적 활성 분자, 이온, 약물 및 그 대사 산물 등이 포함됩니다.

목적에 따라 임상질환 진단, 임상 단백질 분석, 임상 약물 분석, 대사 연구, 병리학 연구, 동종효소 분석, PCR 산물 분석, DNA 단편 및 서열 분석 등으로 나눌 수 있다.

비교할 수 없는 효율성과 속도로 인해 점점 더 많은 과학자들의 관심을 끌고 있습니다.

중국의 전기영동 기술은 너무 늦지 않게 시작되었지만 여러 가지 이유로 인해 대부분의 실험실에서는 여전히 상대적으로 낙후된 전기영동 장비를 사용하고 있습니다.

국내외 과학기술의 급속한 발전과 진단검사의학의 급속한 발전에 따라 전기영동 기술 역시 끊임없이 발전하고 업데이트되고 있으며 임상의학 및 분자생물학 분야에서 매우 폭넓은 응용 가치를 갖고 있습니다. . 나는 이 기술이 계속 발전함에 따라 동료들 사이에서 점점 더 대중화될 것이라고 믿습니다.