RevertAid? 제 1 사슬 cDNA 합성 테스트 키트
(#K 162 1 10 회)
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라이센스 분석
경고
첫 번째 체인 cDNA 의 합성은 RNA 효소 오염을 없애는 조건 하에서 진행되어야 한다고 제안한다. 이동관 흡두와 시험관은 반드시 0. 1% DEPC 로 처리해야 한다 (0. 1% 수용액에서 밤을 새우고100 C 에서 30 분간 가열하고 고압 멸균) 장갑 착용을 강력히 추천합니다.
중요!
-20 C 에 보관하다.
(RNA 를-70 ℃에서 장기간 보존하는 경우)
RNA 대비 반복되는 냉동과 해동을 피했다. RNA 를 녹여 얼음 위에서 조작합니다.
많이. : 12 10
포장 라벨을 참조하여 유통기한을 알아보세요.
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이 테스트 키트 설계는 RNA 템플릿에서 전체 길이의 첫 번째 체인 cDNA 를 준비하는 데 사용됩니다. RevertAid? 첫 번째 체인 cDNA 합성 테스트 키트 은 일종 의 유전자 공학 제품: 모로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사 효소 (RevertAid? M-MuLV RT). 긴 템플릿 (최대 13 kb) 에서 전체 길이 cDNA 를 합성할 수 있습니다. RevertAid? M-MuLV RT 에 의해 합성 된 첫 번째 체인 cDNA 의 위치는 다른 프라이머에 의해 결정됩니다.
무작위 6 량 체 프라이머: 총 RNA 의 모든 RNA 는 RNA 템플릿에서 비특이적 위치의 cDNA 합성을 위한 템플릿입니다.
Oligo(dT) 18: 폴리 (a)+mrna 의 3'- 끝. 이 경우 3'- 폴리아데노신산 꼬리가 있는 mRNA 만 cDNA 합성의 템플릿입니다.
서열 특이성 프라이머: 프라이머 결합 위치.
이 시스템에 의해 합성된 첫 번째 체인 cDNA 는 PCR* 템플릿으로 사용할 수 있습니다. CDNA 합성과 PCR 의 반응 조건이 동일하기 때문에 cDNA 반응 혼합물을 PCR 혼합물에 직접 첨가할 수 있다. 합성된 첫 번째 체인 cDNA 도 두 번째 체인 합성의 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 방사성 표지 된 DNA 는 하이브리드 프로브로 사용될 수 있습니다.
3'- 폴리 아데노신산 꼬리가 있는 1. 1 kb RNA 를 대조군으로 사용한다.
*PCR 프로세스는 Hoffmann-laroche 의 책임입니다.
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패키지 내용
1.RevertAid? M-MuLV 역전사 효소 (200u*/? L):
15? L 효소는 저장 완충액에 용해된다: 50 mm tris-HCl (pH 8.3), 0. 1 m NaCl, 1 mm EDTA, 5 mm DTT, 0 .. X- 100 과 50% 글리세롤.
리보 핵산? 리보 뉴 클레아 제 억제제 (20u**/? L):
15? 효소를 저장 완충액에 녹인다: 20 mm hepes-NaOH (ph 7.5), 50 mm NaCl, 8 mm dtt, 0.5 mm 용리제? 세제와 글리세롤 50%.
3.5x 반응 완충액:
100? 15x 반응 버퍼: 250mm tris-HCl(25℃ pH 8.3), 250 mm KCl, 20 mm MgCl2, 50 mm DTT.
4 4. 10/0mm dNTP 혼합물:
30? L 10mM dGTP, dATP, dTTP, dCTP 수용액.
올리고 뉴클레오티드 (dT) 18 프라이머:
15? L 0.5? G/? L (15A260 단위/밀리리터) 수용액.
6. 무작위 육량 체 프라이머:
15? L 0.2? G/? L (6A260 단위/밀리리터) 수용액.
7. 프라이머 비교:
15? L 10pmol/? L( 1.7a 260 단위 /ml) 17 중합 수용액.
8. RNA 와 비교:
15? L 1. 1 kb 65438 3'-poly(A) 꼬리 +0. 1 kb RNA, 0.5? G/? L.
9.DEPC 처리 수:
2 x 1.5 밀리리터의 탈 이온수가 amilili-q 에 있습니까? 장치의 탈 이온 및 DEPC 처리.
* 1 단위 RevertAid? M-mulvrt: 1 namore dTMP 는 37℃ 10 분 (DE-8 1 에 흡착) 에 폴리 뉴클레오티드 단편과 결합됩니다.
* * 리보 핵산 1 단위? RNA 효소 억제제: 5 ng RNase 효소 A 활성을 50% 억제한다.
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조작 절차
1. PCR 증폭에 적합한 첫 번째 cDNA 체인을 합성합니다.
① 얼음 시험관에서 다음과 같은 반응 혼합물을 준비한다.
템플릿 RNA*:
총 RNA 0. 1-5 마이크로그램.
또는 폴리 (a)+RNA10 ng-0.5 μ g.
혹은 특이성 RNA 0.01PG-0.5 μ G 입니다.
프라이머:
올리고 뉴클레오티드 (dT) 18 프라이머 (0.5 마이크로그램/마이크로리터) 1 마이크로리터
또는 무작위 6 량 체 프라이머 (0.2 마이크로 그램/마이크로 리터) 1 마이크로 리터.
또는 서열 특이성 프라이머 15-20 pmol 입니다.
DEPC 에서 12 마이크로리터로 물 처리
부드럽게 혼합하고 3-5 초 동안 원심합니다.
② 혼합물을 70°C 에서 5 분 동안 부화시키고 차갑지만 짧은 원심력으로 침전물을 수집한다.
③ 시험관을 얼음 위에 놓고 다음 성분을 지정된 순서로 첨가한다.
5 배 반응 완충액 4 마이크로 리터
리보 핵산? 리보 핵산 효소 억제제 (20u/μl) 1μl
10mm dNTP 혼합물 2 마이크로 리터
부드럽게 혼합하고, 잠시 원심력을 내고, 침전물을 모으다.
④ 37 C 에서 5 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25 C 에서 5 분 동안 부화한다).
* 반응에 필요한 총 RNA 또는 폴리 (A)+RNA 의 양은 유전자의 표현 수준에 따라 달라집니다.
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⑤ RevertAid 가입? M-MuLV 역전사 효소 (200 u/μ l) 1 μ l
최종 부피는 20 마이크로리터이다
⑥ 혼합물을 42 C 에서 60 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25°C 에서 부화 10 분, 마지막으로 42 C 에서 60 분 동안 부화한다).
⑦ 70 C 에서 65438 00 분 동안 가열하여 반응을 종료한다. 춥고 춥다.
합성된 첫 번째 체인 cDNA 는 PCR 증폭에 직접 사용할 수 있다. PCR 은 다음 제품으로 수행할 수 있습니다.
Taq DNA 중합 효소 (권장) (# ep040 1, # ep0402, # ep0403, # ep0404);
Taq DNA 중합 효소 (자연, BSA 제외) (# EP0281,# ep0282, # ep0283, # EP0284);
Taq DNA 중합 효소 (자연, BSA 제외) (# EP0071,# EP0072);
2mM dNTP 혼합물 (# r024 1, # r0242);
10mm dNTP 혼합물 (# r0 19 1, # r0 192).
참고:
1. 먼저 전체 RNA 에서 폴리 (A)+RNA 를 분리할 필요는 없지만 최종 제품의 생산량과 순도를 높일 수 있습니다.
2.RNA 샘플은 게놈 DNA 에 의해 오염 될 수 없습니다.
3.oligo(dT) 18 프라이머는 최적화 조건을 필요로 하지 않지만 반응에서 합성된 cDNA 평균 길이에 따라 무작위 6 체 프라이머와 RNA 의 비율이 엄격하다. 육합체 /RNA 의 비율을 늘리면 CDNA 가 더 짧아지고 (~500 bp) cDNA 의 생산량이 증가하고, 이 비율을 낮추면 더 긴 산물로 이어질 수 있다.
4. 반응온도를 45°C 로 높이면 GC mRNA 가 풍부한 2 차 구조문제를 완화할 수 있다.
5. 반응산물 분석 (4 장 참조) cDNA 에는 [32P] 방사성 표시가 필요합니다. 이를 위해 RevertAid 를 추가하시겠습니까? 플러스 10μCi[? -32P]dNTP (예: dATP) 는 반응 혼합물에 추가됩니다. 1μl 0.5M EDTA 를 추가하여 반응을 종료하고 얼음 위에 놓습니다.
합성 cDNA 는-20 ℃에 저장해야 한다 .....
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2. 두 번째 체인 합성에 적합한 첫 번째 체인 cDNA 를 합성합니다.
① 얼음 시험관에서 다음과 같은 반응 혼합물을 준비한다.
템플릿 RNA*:
폴리 아데노신산+RNA 1 마이크로 그램
또는 특정 RNA 0.5- 1 μ g 입니다.
프라이머:
올리고 뉴클레오티드 (dT) 18 프라이머 (0.5 마이크로그램/마이크로리터) 1 마이크로리터
또는 무작위 6 량 체 프라이머 (0.2 마이크로 그램/마이크로 리터) 1 마이크로 리터.
또는 서열 특이성 프라이머 100pmol 입니다.
DEPC 에서 12 마이크로리터로 물 처리
부드럽게 혼합하고 3-5 초 동안 원심합니다.
② 혼합물을 70°C 에서 5 분 동안 부화시키고 차갑지만 짧은 원심력으로 침전물을 수집한다.
③ 시험관을 얼음 위에 놓고 다음 성분을 지정된 순서로 첨가한다.
5 배 반응 완충액 4 마이크로 리터
리보 핵산? 리보 핵산 효소 억제제 (20u/μl) 1μl
10mm dNTP 혼합물 2 마이크로 리터
부드럽게 혼합하고, 잠시 원심력을 내고, 침전물을 모으다.
④ 37 C 에서 5 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25 C 에서 5 분 동안 부화한다).
⑤ RevertAid 가입? M-MuLV 역전사 효소 (200 u/μ l) 1 μ l
최종 부피는 20 마이크로리터이다
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⑥ 혼합물을 42 C 에서 60 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25°C 에서 부화 10 분, 마지막으로 42 C 에서 60 분 동안 부화한다).
⑦ 70 C 에서 65438 00 분 동안 가열하여 반응을 종료한다. 춥고 춥다.
합성된 첫 번째 체인 cDNA 는 두 번째 체인 합성에 사용할 수 있습니다. 다음 제품을 사용하여 합성을 완료할 수 있습니다.
DNA 중합 효소 I (#EP004 1, # ep0042);
T4 DNA 연결 효소 (# el00 14, # el00 1 1, # el0012)
리보 핵산 효소 H (#EN020 1, # en0202);
핵산 효소 S 1 (#EN032 1).
노트
1. 합성의 특이성과 효율성을 높이기 위해서는 폴리 (A)+조각이 총세포 RNA 에서 분리되어야 합니다.
2.oligo(dT) 18 프라이머는 최적화 조건을 필요로 하지 않지만 반응에서 합성된 cDNA 평균 길이에 따라 무작위 6 체 프라이머와 RNA 의 비율이 엄격하다. 육합체 /RNA 의 비율을 늘리면 CDNA 가 더 짧아지고 (~500 bp) cDNA 의 생산량이 증가하고, 이 비율을 낮추면 더 긴 산물로 이어질 수 있다.
3. 반응온도를 45°C 로 높이면 GC mRNA 가 풍부한 2 차 구조문제를 완화할 수 있다.
4. 반응산물 분석 (4 장 참조) cDNA 에는 [32P] 방사성 표시가 필요합니다. 이를 위해 RevertAid 를 추가하시겠습니까? 플러스 10μCi[? -32P]dNTP (예: dATP) 는 반응 혼합물에 추가됩니다. 1μl 0.5M EDTA 를 추가하여 반응을 종료하고 얼음 위에 놓습니다.
5. 합성된 cDNA 는 -20℃ 에 저장해야 합니다.
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높은 비 방사성을 갖는 첫 번째 사슬의 합성
① 얼음 시험관에서 다음과 같은 반응 혼합물을 준비한다.
템플릿 RNA*:
폴리 아데노신산+RNA 0.5 마이크로 그램
프라이머:
올리고 뉴클레오티드 (dT) 18 프라이머 (0.5 마이크로그램/마이크로리터) 1 마이크로리터
또는 무작위 6 중합체 프라이머 (0.2 마이크로그램/마이크로리터) 1.5 마이크로리터.
또는 서열 특이성 프라이머 100pmol 입니다.
DEPC 는 물을 8μl 로 처리합니다
부드럽게 혼합하고 3-5 초 동안 원심합니다.
② 혼합물을 70°C 에서 5 분 동안 부화시키고 차갑지만 짧은 원심력으로 침전물을 수집한다.
③ 시험관을 얼음 위에 놓고 다음 성분을 지정된 순서로 첨가한다.
5 배 반응 완충액 4 마이크로 리터
리보 핵산? 리보 핵산 효소 억제제 (20u/μl) 1μl
1 0mm dGTP, dCTP, dTTP 혼합물1마이크로리터
0. 1 mm dATP* 4 마이크로리터
부드럽게 혼합하고, 잠시 원심력을 내고, 침전물을 모으다.
④ 37 C 에서 5 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25 C 에서 5 분 동안 부화한다).
⑤ 가입:
[? -32p] 데이터 (1 0 밀리그램/밀리리터)1마이크로리터
RevertAid? M-MuLV 역전사 효소 (200u/μl) 1μl
최종 부피는 20 마이크로리터이다
* 이 키트에는 개별 dNTP 솔루션이 포함되어 있지 않습니다. DNTP 컬렉션 (#R0 18 1) 을 사용하여 합성합니다. 。
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⑥ 혼합물을 42 C 에서 60 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25°C 에서 부화 10 분, 마지막으로 42 C 에서 60 분 동안 부화한다).
⑦ 5μl 0.5m EDTA 를 첨가하여 반응을 종료한다.
⑧ 필요한 경우 등체적 (25 μ l) 의 0.6N NaOH 를 넣어 RNA 를 가수 분해하고 70°C 에서 30 분간 부화한다.
⑨ Sephadex 에서? 결합되지 않은 dNTPs 는 G-50 컬럼 크로마토 그래피로 제거됩니다.
높은 비율 활성 (>: 107 dpm/μg) 을 가진 첫 번째 체인 cDNA 는 Southern 잡교 프로브로 사용할 수 있습니다.
참고:
활성보다 높은 cDNA (108dpm/μg 이상) 를 얻기 위해 100μCi 의 [? 반응 혼합물에 -32P]dATP 를 추가합니다. 최종 반응 시스템이 20μl 보다 크면 10μl [? -32P]dATP (10mCi/ml) 는 준비한 반응 혼합물을 시험관 (5 단계) 으로 옮깁니다. 그런 다음 합성을 계속합니다.
1 차 사슬 cDNA 생성물을 분석하십시오.
알칼리성 아가로 오스 겔 전기 영동은 방사성 마커의 cDNA 제품만 확인하거나 분석할 수 있다.
첫 번째 cDNA 사슬의 생산량을 확정하다.
① 1μl 샘플을 두 개의 DE-8 1 필터 (1.5x 1.5cm) 로 점화한다.
(2) 베이킹 램프 건조 필터. 여과막을 보존하고, 직접 그것으로 샘플의 총 방사능을 측정한다.
③ 또 다른 여과막 세척 5min10ml 7.5% (w/v) na 2 hpo 4x12h2o 5 분 3 회; 물, 아세톤 또는 96% 에탄올로 헹구십시오.
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(4) 베이킹 램프는 청소 후 여과막을 건조시킵니다.
⑤ 두 개의 여과막 (세척과 세척되지 않은 것) 을 방사성 카운터로 옮기고 계산한다.
⑥ 첫 번째 cDNA 체인의 수율은 다음 공식을 사용하여 계산됩니다.
DNTP 의 최종 농도가 1.0mM 인 경우 (20μl) 의 dATP 몰 수는 2x 10-8 몰입니다. 표시된 dATP 수는 상당히 적으므로 무시할 수 있습니다. 그러나, 높은 비율의 활성을 가진 cDNA 의 경우 (3 장), 표기되지 않은 dATP 의 최종 농도는 0.02 mm ... 측량에서 무어 dATP 를 계산하기 위해, 표기되지 않은 무어와 표기된 무어를 더해야 한다.
MW 는 핵산의 평균 분자량으로 333x 106 μg/mol 에 해당한다. 네 개의 dNTP 가 모두 반응에 관여하기 때문에 MW 에 4 를 곱합니다.
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예: 예:
씻은 필터가 4x 104dpm 을 생성하면 씻지 않은 필터는1.8X106DPM 을 생성합니다.
그래서:
CDNA 생산량 (μ g) = 4x104dpm x (2x10-8mol datp) x 4x (333x1;
1.8x 106dpm
CDNA 생산량% = 0.59 마이크로그램 x 100% = 59%
1 마이크로그램
알칼리성 아가로 오스 겔 전기 영동 분석
[32P] 로 표시된 첫 번째 체인 cDNA 의 합성물은 알칼리성 진지당 젤 전기 영동에 의해 분석될 수 있다. 마찬가지로, 합성물과 사용된 DNA 표기물은 모두 [32P] 로 표시해야 한다.
① 준비 1.4% 진지당 젤 (30mM NaCl, 2mM EDTA), 알칼리성 전기 영동 완충액 (30mM NaOH, 2mM EDTA) 에서 최소 1h 의 균형을 잡는다
② 샘플 (1x 105 DPM) 을 별도의 시험관으로 옮겨 5μl 물로 희석한다. 5μl 2x 로딩 버퍼를 추가하십시오.
(60mM NaOH, 2mM EDTA, 6% Ficoll? 400,0.05% 브로 모 페놀 블루). 표시된 DNA 표시는 동일한 2x 로딩 버퍼액으로 희석해야 합니다.
2x 상샘플 버퍼액은-20 C 로 유지하거나 사용하기 전에 염료를 첨가해야 합니다.
(3) 샘플을 넣고 알칼리성 진지당 젤에서 염료가 겔 2/3 에 가까운 위치로 이동할 때까지 5V/cm 으로 전기 영동을 한다.
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④ 젤은 실온에서 7% 트리클로로 아세트산 (TCA) 에 30 분 동안 담갔다.
⑤ 젤은 겔 건조기에 진공 건조되거나 유리판에 눌린 다층 티슈 아래 건조 1-2 시간.
⑥ 건조한 젤을 플라스틱 덮개로 덮고 실온에서 엑스레이 필름을 노출시켜 밤을 지낸다.
종합을 통제하다
3'- 폴리아데노신산 꼬리가 있는1..1KBRNA 를 대조군으로 제공한다.
① 얼음 시험관에서 다음과 같은 반응 혼합물을 준비한다.
템플릿 RNA*:
비교 RNA 0.5 마이크로 그램
프라이머:
올리고 뉴클레오티드 (dT) 18 프라이머 (0.5 마이크로그램/마이크로리터) 1 마이크로리터
또는 무작위 6 량 체 프라이머 (0.2 마이크로 그램/마이크로 리터) 1 마이크로 리터.
또는 대조군 (서열 특이성) 프라이머 (10 pmol) 2 μ l
DEPC 는 물을 1 1μl 로 처리합니다
부드럽게 혼합하고 3-5 초 동안 원심합니다.
② 혼합물을 70°C 에서 5 분 동안 부화시키고 차갑지만 짧은 원심력으로 침전물을 수집한다.
③ 시험관을 얼음 위에 놓고 다음 성분을 지정된 순서로 첨가한다.
5 배 반응 완충액 4 마이크로 리터
10mm dNTP 혼합물 2 마이크로 리터
리보 핵산? 리보 핵산 효소 억제제 (20u/μl) 1μl
부드럽게 혼합하고, 잠시 원심력을 내고, 침전물을 모으다.
④ 37 C 에서 5 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25 C 에서 5 분 동안 부화한다).
⑤ 가입:
[? -32p] 데이터 (1 0 밀리그램/밀리리터)1마이크로리터
RevertAid? M-MuLV 역전사 효소 (200u/μl) 1μl
최종 부피는 20 마이크로리터이다
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⑥ 혼합물을 42 C 에서 60 분 동안 부화한다 (무작위 6 합체 프라이머는 25°C 에서 부화 10 분, 마지막으로 42 C 에서 60 분 동안 부화한다).
⑦ 1μl 0.5M EDTA 를 추가하여 반응을 중단하고 얼음 위에 놓습니다.
⑧ 제품 분석 (4 장 참조).
참고:
1. 비교 RNA 를 사용할 때 첫 번째 체인 cDNA 의 생산량은 일반적으로 50% 를 초과합니다.
2. 비교용 과부 (dT) 18 또는 대비 (서열 특이성) 프라이머로 합성하면 1. 1 kb 의 또렷한 스트라이프를 관찰할 수 있습니다. 무작위 6 합체 프라이머를 사용하면 일반적으로 몇 개의 짧은 밴드를 관찰할 수 있다.
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자주 묻는 질문
저수율과 탐지산물은 역전사 효소 반응 실패의 두 가지 뚜렷한 표시이다.
가능한 원인 검사 및 치료
DNA 템플릿 분해. 아세탈과 포름알데히드 젤전기 수영은 RNA 템플릿의 무결성을 탐지한다. 대비 RNA 는 젤에1..1KB 의 밝은 벨트를 가지고 있어야 합니다. 샘플 RNA 를 처리할 때 RNA 효소에 오염되지 않도록 주의하세요. 템플릿 RNA 와 비교 RNA 를-70 C 에 보관하여 샘플이 반복적으로 얼지 않도록 하고 녹은 후 얼음 위에 놓는다.
리보 핵산 효소는 반응 혼합물을 오염시켰다. 대조군을 사용하고 결과 생성물을 분석 (대조군 합성 참조). 무균 상태에서 반응 혼합물을 준비하고, 항상 장갑을 끼고, DEPC 를 사용하여 샘플과 접촉하는 모든 기구를 처리한다. 주로 용액을 오염시키지 않는다.
RevertAid? M-MuLV 역전사 효소 억제제 (SDS, EDTA, 구아니딘 염, 인산염, 피로 인산염, 폴리아민, 아민, 아정민). 1μg 를 RNA 와 RNA 샘플에 섞어 동시에 합성합니다. Oligo(dT) 18 또는 비교 프라이머를 사용하는 경우 합성 수율은 50% 이상이어야 하며 1. 1kb 의 밝은 부가 밴드를 볼 수 있습니다. 96% 에탄올로 RNA 샘플을 침전시키고 75% 에탄올로 세탁합니다 (DEPC 에서 처리한 물로 에탄올 용액을 준비해야 함). 반응 혼합물에 억제제를 첨가하지 마세요.
잘못된 프라이머는 다른 프라이머와 함께 제품을 분석하는 데 사용됩니다. 서열 특이성 프라이머는 RNA 의 3' 끝과 보완해야 한다. RNA 템플릿에 전사 인터럽트가 포함되어 있는 경우 임의 6 체 프라이머를 사용하여 합성합니다.
합성된 첫 번째 체인 cDNA 서열은 틀렸다. CDNA 의 반복 합성.
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품질 관리
폴리아데노신 산성화 RNA 전사물을 1 차 체인 cDNA 합성반응의 대조군 템플릿 (특이성 제어 프라이머, oligo(dT) 18, 임의 육합체 프라이머) 으로 사용하여 테스트 키트 내 모든 시약 검출. 。
품질 검증: Birute Gagiliene