양조효모 게놈을 사용하여 PCR 을 통해 SBP 1 및 STM 1 의 인코딩 시퀀스를 얻습니다. PCR 생성물은 각각 59 와 39 의 끝에 NdeI 와 XhoI 의 날카로운 점을 가지고 있다. 조각은 pET- 15b 로 제한되고 Sbp 1p 및 Stm 1p 에 His6- 으로 추가됩니다. 레이블의 표현은 pET-SBP 1 및 pET-STM 1 플라스미드를 생성합니다. HMT 1 은 실험실에서 구할 수 있습니다 (Chern 등, 2002 년). PBS-MP 에 삽입합니다 (Hwang 등 1999). E.*** 고 메치오닌 아미노 펩 티다 제 (MAP) 유전자 (pBS-MAPp-hmt 1) 는 변하지 않았다. PBS-MAPP-HMT 1 증폭 STM 1 유전자의 프로모터 서열에서 코돈 1 1 뉴클레오티드 39 의 pgex 를 종료합니다 STM 1 쌍륜 마차에서 말 두 마리가 일렬로 늘어섰다. 그리고 HMT 1 유전자는 NdeI 와 BamHI 를 각각 가진 59 와 39 의 초기 지식을 이용하여 PCR 제품을 STM 1 을 시작 코돈으로 59 끝에 연결하고 PET-/KLOC-가 되었습니다. His6 태그 pET- 15b 를 인코딩하는 캐리어 시퀀스는 NcoI 와 NdeI 사이트 사이에 있습니다. 따라서 STM 1 은 T7 프로모터에 의해 제어되는 N- 끝 His6- tag 융합 단백질로 표현됩니다. 마지막으로 pet-STM1-(mapp-HMT1) was 에서는 ， SBP 1 p/HMT1STM/kloc-0 생성/(pet-SBP/klls) 대신 SBP1을 사용합니다 PET-STM 65438 트롬빈 절단 부위 및 STM 1 R236k, R237k, R240K 및 R243K 돌연변이를 생성하는 위치-위치 방향을 통해 빠르게 변하는 방향 돌연변이를 통해 제조업체의 지시에 따라 돌연변이 요소 (Stratagene) 를 형성합니다. 배양물이 600 nm 에서 0.6 의 광흡수율에 이를 때까지 플라스미드로 전환된 세포는 30 C 에서 Lauia 의 육수에서 자란다. 그런 다음 이소 프로필 B-D- 1- 황 갈락토오스 피란 글리코 시드 (IPTG, 1 mM 최종 농도) 를 첨가하고, 세포는 수확 전에 4 시간 동안 배양한다. 세포가 분열된 후 제조사의 지시에 따라 Ni2 킬레이트 구슬 (Novagen) 로 재조합단백질을 순화한다.