실험 요약
TRIzol 을 통해 샘플의 총 RNA 를 추출하고 역전사를 통해 cDNA 를 얻어 다운스트림 실험에 사용한다.
1. 시약 및 소모품
시약 및 소모품
Primescript ii1ST strand cdna 합성 테스트 키트, 바오 생물 공학 (대련) 유한 회사, 6210b; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다 총 RNA 추출 시약 TRIzol, 난징 중딩 생명기술유한공사, RK01-100;
DL2000 DNA 태깅 (100, 250,500,750, 1000,1500,2000bp) GelStain, 베이징 전식금 생명기술유한공사, GS101-01;
DEPC, shima 회사, d5758-25ml; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다 아가로 오스, Biowest, 스페인, 91622;
원심관, 미국 Axygen, 311-01-051; 총 머리, 엑스겐, 미국;
다른 시약 들은 중국에서 모두 분석순이다.
2. 주요 실험 장비
주요 실험 기구
초극세 자외선 분광 광도계: NanoDrop2000, Thermo 회사; 데스크탑 고속 냉동 원심 분리기, 베이커맨, Allegra 21R; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다
전자 저울, AHOMS 회사, AR5120; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다 자외선 투과기, Amersham Pharmacia, Hofermv-25;
전기 영동 장치: TY2795, BIO-RAD 회사; 전기 영동 탱크: 세포 GT 세포, BIO-RAD 회사;
젤 이미징 분석 시스템: GelDocXR 모델, BIO-RAD 회사 눈송이제빙기, 일본 산양회사, Sim-F140 AY65
이동기, 독일 Eppendorf.
실험 방법 및 결과
3. 1.RNA 추출
(1) 조직 균질화: 샘플에 1 ml TRIzol 시약 (조직 볼륨의 볼륨이 TRIzol 볼륨의 10% 를 초과해서는 안 됨) 를 넣고 이동액관으로 반복해서 바람을 불었다.
(2) 핵산과 단백질이 완전히 풀릴 때까지 상온에서 5 분 동안 균풀을 놓는다. 0.2 ml 염소 모조를 1 ml TRIzol 시약 사용량의 균질액에 넣고 시험관 덮개를 덮고 15 s 를 수동으로 심하게 흔들었다가 실온에서 2 ~ 3 min 을 고정시킵니다.
(3) 4 C 에서 10,000g, 원심10 분.
(4) 상층수 (무색) 를 조심스럽게 흡수하고 새로운 시험관에 추가하면서 수상을 흡수하는 부피를 계산한다.
(5) 등체적인 예냉된 이소프로판올을 넣고 뚜껑을 덮고 가볍게 흔들어줍니다.
(6) 실온에서 65438 00 분 동안 RNA 가 완전히 가라앉을 때까지 가만히 두세요.
(7) 4 C 에서 10,000G 원심10 분.
(8) 상청액을 버리고 (침전을 버리지 않도록 주의) 각 시험관에 1 ml 의 75% 에탄올을 넣고 시험관을 덮고 원심관을 가볍게 흔들어 남아 있는 이소프로판올과 소금을 제거한다. 4 C 에서 7,500 원심력 5 분
(9) 상청액을 버리고 뚜껑을 열고 RNA (실온에서 휘발하거나 진공 건조) 를 가라앉히고 건조한다. RNA 침전물은 완전히 건조할 수 없습니다. 그렇지 않으면 녹기 어렵습니다.
(10) RNA 침전물을 적당량의 RNA 효소를 함유하지 않는 물에 녹인다.
3.2.RNA 아가로 오스 겔 전기 영동 분석
추출한 RNA 는 진지당 젤 전기 영동을 하는데, 전기 영동지도는 다음과 같다.
3.3.RNA 농도 및 순도 시험
3.4.RNA 역전사 cDNA
3.4. 1. 게놈 DNA 제거
중딩 회사의 DNase I 를 사용하여 RNase 가 없는 원심관에 다음과 같은 혼합 용액을 준비합니다.
3.4.2 역전사 반응
PCR 시험관에서 다음과 같은 반응 혼합물을 준비합니다.
65 C 에서 5 min 을 반응한 다음 얼음욕에서 식힌다.
1 단계 반응관에서 다음과 같은 역전사 반응 용액을 준비한다.
역전 반응 조건은 30 C10 분, 42 C 30 분, 95 C 5 분입니다. 얼음욕이 식다. 이 제품은-20 ℃의 냉장고에 저장되어 있다.
당신과 SCI 는 RT-PCR 기술 서비스라는 한 가지만 있으면 됩니다.
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