TG 16 고속 원심분리기 (193 10 g, 창사영태기기유한공사) UV? 2000 자외선-가시 분광 광도계 (유니코 상하이 기기 공장) Vertex 70 적외선 분광계 (독일 브룩); 나? 3250B 자력 교반 인큐베이터 (천진 오트산츠 기기 유한회사).
메조 포러스 분 자체 SBA? 계면활성제 Pouronic P123 (EO20 PO70 EO20, 미국 Aldrich 회사) 을 템플릿으로, 농염산 (35% ~ 37%) 을 촉매제로/Kloc-를 합성했다. 원래 실리콘산 에틸 에스테르 (Si(OC2H5)4, TEOS, 95.0%, Junsei 화학회사. Lu00 1 과 LLSD 1 으로 번호가 매겨진 메조 포러스 분자 시브의 합성 방법은 거의 동일하지만 원료는 약간 다릅니다. 이들의 BET 비 표면적은 762 m2/g, 구멍 용량은 0.87 cm3/g, 구멍 지름은 7.65438±0.8nm, 벽 두께는 3.55nm .. 가짜 실크 효모 리파아제 (CRL) 는 일본 Amano Enzyme Technology 에서 구입한다 BCA 단백질 정량 테스트 키트 미국 Pierce 에서 구매했습니다. 실험용수는 2 차 증류수이다.
2.2 푸리에 변환 적외선 (FT? IR) 테스트
샘플과 KBr 은115 C 진공 건조 10 h 에 있습니다. 300 mg KBr 과 2.2 mg 샘플을 섞어 발우에서 가는 가루로 갈아서 정제로 눌러줍니다. 건조 후 즉시 적외선 분광기의 제자리에 넣어 테스트해 보세요. 기기 해상도는 2 cm- 1, 스캔파 범위는 4000 ~ 400cm- 1, 스캔 횟수는 128 회입니다.
SBA 의 2.3 CRL? 15 에 고정
CRL 인산염 완충액 (pH 7.0) 을 3000 r/min 원심 65438±05min 으로 모아서 원효소액을 얻는다. 적당량의 SBA 는 어떻게 되나요? 15 를 콜라게나 제 용액에 넣고15 ℃수욕에서 150 ~ 200 r/min 으로 21을 섞는다 인산염 완충액으로 분 자체 4 회 세탁, 느슨한 부착 효소 제거, 세제액을 10000 r/min 원심15 분, 세제액으로 제거한다. 원효소액, 추출액, 세척액의 효소 단백질 함량을 측정하고, 자재 균형에 따라 효소 단백질의 고정량 (Mg) 을 계산하고, 단위 질량 분 자체의 효소 단백질 고정량을 효소 부하량 (Mg/g) 으로 측정한다.
2.4 고정 CRL 누출
위에서 언급한 효소 SBA 는? 15 를 70 mL 인산염 완충액으로 옮기고15 C 수욕에서 150 ~ 200 r/min 으로 섞어서 정기적으로 샘플링합니다. 샘플을 10000 r/min 원심 분리 15 min 으로 상청액에서 효소와 단백질의 누출을 분석합니다.
2.5 단백질 정량 방법
각각 단파장 자외선 분광 광도법, 쌍파장 자외선 분광 광도법, BCA 방법을 이용하여 샘플의 단백질 함량을 측정한다. 단파장 자외선법의 공식은 C (단백질) (g/L) =F×A280×D/d 입니다. 여기서 A280 은 280 nm 파장의 흡광도이고, D 는 용액의 희석 배수이며, D 는 시간 대비 색접시의 두께 (cm) 입니다. Warburg, 쌍파장 자외선법? 기독교 공식은 c (단백질) (g/l) =1.55 a280-0.76 a260; 로리? 칼커의 공식은 c (단백질) (g/l) = 1.45A280-0.74A260 입니다. 여기서 A260 과 A280 은 각각 260 nm 와 280 nm 의 흡광도입니다. BCA 법은 미국 Pierce 의 단백질 정량법에 따라 측정된다. 분석화학 제 37 권 8 기 상연 등: 메조 포러스 분 자체 SBA? 리파아제 고체 정량 분석 15 3. 1 단백질 정량 방법 비교
그림 1 농도가 다른 CRL 용액은 260~280 nm 에 강한 흡수봉이 있어 단백질 중 방향족 아미노산의 특징봉으로 단백질 함량 측정에 쓰인다. 조효소 농도가 6 g/L 인 CRL 용액을 서로 다른 시간에 희석하여 알려진 상대 농도의 효소 용액을 얻는다. 단파장 및 쌍파장 자외선법과 BCA 방법으로 효소의 농도를 각각 측정하여 측정된 농도가 상대 농도와 일치하는지 검증하여 각 검출 방법의 정확성을 산출한다. 그림 2 의 결과는 BCA 방법의 측정 결과가 희석 샘플의 상대 농도와 가장 가깝고, 쌍파장 자외선법의 측정치가 BCA 법에 가깝고, 단파장법의 측정 결과가 BCA 법과 쌍파장 자외선법보다 훨씬 높다는 것을 보여준다. 표 1 중 상대 농도 계산 결과에 따르면 BCA 방법의 상대 오차가 가장 적고 단일 파장 및 이중 파장 자외선 방법의 상대 오차가 크다. BCA 방법의 원리는 CuSO4 의 Cu2+ 킬레이트 단백질 분자로 흡광도를 테스트하기 위해 발색반응이 발생해 간섭 방지 능력이 강하고 정확도가 높기 때문이다. 자외선 분광 광도법은 절차가 적고, 간단하고 빠르며, 발색제가 필요하지 않으며, 샘플을 소비하지 않는다. 광밀도 값을 직접 감지하는 것은 용액 중 불순물의 간섭에 크게 영향을 받고 오차가 크다.
메조 포러스 분자 시브가 흡광도에 미치는 영향을 조사하기 위해 0. 1, 0.6, 0.9 mg SBA? 15 (Lu00 1 없음), 증류수를 기준 샘플로 사용하여 흡광도를 측정하고 단백질 측정에 의한 농도 편차를 계산합니다. 표 2 는 SBA 를 보여 줍니까? 15 에는 명백한 자외선 흡수가 있습니다. 따라서 이 실험의 샘플 용액은 10000 r/min 으로 원심시켜 포조 분자 시브의 흡광도 간섭을 제거한다. 표 1 다른 방법으로 단백질 농도표 2 SBA 측정? 15 가 흡광도에 미치는 영향 표 3 은 다양한 정량 방법으로 측정된 SBA 를 보여줍니다. CRL 의 고정 금액은 15 (Lu00 1 없음) 이고 세 번의 평행 실험의 초기 조효소 농도는 모두 6 g/L, SBA 입니까? 15 전달체 사용량은 0.36 g 로 쌍파장 자외선법 측정 결과가 BCA 법보다 약간 높다. 단파장 자외선법의 결과는 쌍파장법과 BCA 법보다 훨씬 높다. 표 3 은 또한 BCA 방법의 정밀도가 단파장 및 쌍파장 자외선법보다 높다는 것을 보여준다. BCA 법은 발색반응에 의존하여 흡광도를 감지하고 감도가 높으며, 메조 포러스 분자 체는 발색반응에 참여하지 않고, 간섭 내성이 강하고 재현성이 뛰어나며, 메조 포러스 분자 체 운반체의 효소 고정량과 효소 누출량을 검출하는 데 더 적합하기 때문이다. 자외선 분광 광도법은 용액 속의 불순물과 잔류공조에 따라 세 개의 표인 SBA 로 나뉜다. 15 에 CRL 및 효소 부하의 고정량
◆: 고정화 단백질의 양; ◇: 효소량을 넣다. 하위 체 간섭이 크다. 쌍파장 자외선법 측정 효소 고정화의 결과는 BCA 법과 비슷하기 때문에 실험 조건이 제한적이거나 샘플 간섭 요인이 적으면 BCA 방법 대신 쌍파장 자외선법으로 효소 고정화를 측정할 수 있다. 각 샘플 중 메조 분자 시브의 간섭은 자재 균형 계산을 통해 상쇄될 수 있다.
3.2 다른 초기 효소 농도에서 BSA? 15 담체에 있는 효소의 고정량
BCA 법은 서로 다른 초기 효소 농도에서 LLSD 1 CRL 에 대한 고정량을 측정한다. 그림 3 은 효소 농도가 낮을 때 SBA 가? 15 캐리어의 CRL 에 대한 고정량과 효소 부하량은 효소 농도의 증가에 따라 선형적으로 증가하지만 효소 단백질 농도가 약 0.29 g/L (조효소 농도는 약 1 g/L) 에 이르면 고정량과 효소 부하량은 안정된 수준에 도달한다.
3.3 두 가지 SBA? 15 벡터의 효소 고정량
초기 효소 농도가 2 g/L 이고 분 자체 사용량이 0. 12 g 인 동일한 조건에서 LLSD 1 및 LU0 1 CRL 에 대한 고정화 그림 4 llsd/kloc-
Llsd 1 (a) 및 lu00 1 (b) 의 그림 4 SEM 이미지 양은 각각 13.70 및 2.00mg； 입니다. 효소 부하는 각각 1 14.2 및 16.6 mg/g 입니다. LLSD 1 의 고정량과 효소 부하가 Lu00 1 보다 훨씬 크다는 것을 알 수 있습니다. 그림 4 는 LLSD 1 및 Lu00 1 의 SEM 사진을 보여줍니다. 그들의 모양과 모양이 기본적으로 일치하며 모두 SBA 에 속한다는 것을 알 수 있습니까? 15 [9] 의 기존 쉐이프는 크기면에서 크게 다르지 않습니다. 그림 5 는 LLSD 1 및 Lu00 1 에 대한 FT 를 보여줍니다. 적외선 스펙트럼을 보면 LLSD 1 표면의 수산기 수가 Lu00 1 보다 크다는 것을 알 수 있다. 효소의 흡착은 효소와 메조 포러스 물질 표면의 수산기 사이의 수소 결합을 통해 이루어지므로 메조 포러스 분자 체 표면의 수산기는 수소 결합을 통해 효소 흡착 [10] 을 촉진 할 수있다. 그래서, FT? 그림 5 의 Lu00 1( 1) 및 LLSD 1(2)? 적외선 스펙트럼
그림 5 피트? 루001(1) 과 1 (2
3.4 SBA? 15 고정화 효소 누출
고정화 효소는 쉽게 물에 떨어져 유리 효소 즉' 누출' [1 1] 이 된다. 그림 6 은 100 h 이후 Lu00 1 의 고정 CRL 이 버퍼 용액에서 0.56%, LLSD 1 의 누출률이 0.53% 임을 보여줍니다. 15 는 효소 고정화의 좋은 전달체이다. 누출률이 낮으면 SBA 와 관련이 있을 수 있습니까? 15 구멍 지름. 연구 [3, 12] 에 따르면 메조 포러스 물질의 기공 크기가 효소 분자의 크기에 적합할 때 고정화 효소의 안정성이 더 좋다. Lu00 1 과 LLSD 1 의 구멍 지름은 모두 7. 18 nm 이고, candida lipase 의 운동 지름은 약 5 nm 이므로 효소 분자가 구멍에 정확히 고정되어 누출되지 않습니다.
◆, ■, ▲, ● 새는 것이다. ◇, △, ◇ 는 누출율이다. 여기서 ◆, ◇: 0. 12g LLSD 1, 효소 부하1/kloc. ■, 입: 0.24 g LLSD 1, 가효소111.3mg/g; ▲, △: 0.36 g Lu00 1, 효소 부하14.2mg/g; ●, ○: 0.36 g lu00 1, 효소 부하 16.6 mg/g. 1 RAC, 신 y, 유 j, 아크만 E J
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