DNA 염기서열 결정에는 수동 염기서열분석과 자동 염기서열분석으로 구분되는데, 수동 염기서열분석에는 Sanger Dideoxy Chain Termination 방식과 Maxam-Gilbert 화학적 분해 방식이 있습니다. 자동화된 서열 분석은 실제로 오늘날 DNA 서열 분석의 주류가 되었습니다. 미국 PE ABI사는 373, 377, 310, 3700, 3100 등의 DNA 시퀀서를 생산해왔다. 그 중 310은 임상시험실에서 가장 많이 사용되는 모델이다. 본 실험에서는 ABI PRISM 310 DNA 시퀀서의 시퀀싱 원리와 작동 절차를 소개합니다.
원리 ABI PRISM
310 유전자 분석기(예: DNA 시퀀서)는 모세관 전기영동 기술을 사용하여 기존 폴리아크릴아미드 플레이트 전기영동을 대체하고 회사의 특허받은 4색 형광 염료 라벨링 ddNTP를 적용합니다. (표지된 터미네이터 방법)이므로 단일 프라이머 PCR 시퀀싱 반응을 통해 생성된 PCR 산물은 3'''' 말단에 1개의 염기가 다른 4개의 서로 다른 형광 염료가 포함된 단일 가닥 DNA 혼합물이므로 시퀀싱이 이루어집니다. 4가지 형광 염료의 PCR 산물은 모세관에서 전기영동할 수 있으므로 레인 간 이동성 차이의 영향을 피하고 시퀀싱 정확도를 크게 향상시킬 수 있습니다. 분자의 크기가 다르기 때문에 모세관 전기영동에서의 이동도도 다릅니다. 모세관 판독창을 통과할 때 레이저 검출기 창에 있는 CCD(전하결합소자) 카메라 검출기가 형광 분자를 하나씩 검출하여 여기시킬 수 있습니다. 형광은 서로 다른 기본 정보를 나타내는 서로 다른 색상의 형광을 구별하기 위해 격자로 분리되며 동시에 CCD 카메라에 이미지화됩니다. 분석 소프트웨어는 서로 다른 형광을 DNA 서열로 자동 변환하여 DNA 서열 분석의 목적을 달성할 수 있습니다. 분석 결과는 겔 전기영동 패턴, 형광 흡수 피크 다이어그램, 염기 배열 순서 등 다양한 형태로 출력될 수 있습니다.
자동 젤 충전, 자동 시료 주입, 자동 데이터 수집 및 분석, 기타 전자동 컴퓨터 제어 기능을 갖춘 전자동 컴퓨터 제어 기기로 염기 서열이나 크기 결정 및 DNA 단편의 정량이 가능한 고급 정밀 기기입니다. . PE Company는 DNA 시퀀싱 젤(POP 6) 및 GeneScan 젤(POP 4)을 포함한 젤 폴리머도 제공합니다. 이러한 겔 입자의 기공 크기는 균일하므로 일관성 없는 겔 준비 조건이 시퀀싱 정확도에 미치는 영향을 방지합니다. 주로 모세관 전기 영동 장치, 매킨토시 컴퓨터, 컬러 프린터 및 전기 영동 및 기타 액세서리로 구성됩니다. 컴퓨터에는 데이터 수집, 분석 및 기기 작동을 위한 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 최신 CCD 카메라 검출기를 사용해 DNA 시퀀싱을 2.5시간으로 단축하고, PCR 단편 크기 분석 및 정량 분석을 10~40분으로 단축한다.
본 장비는 DNA 염기서열분석, PCR 단편크기 분석, 정량분석 등의 기능을 갖추고 있어 DNA 염기서열분석, 이형접합성 분석, 단일가닥 입체구조 다형성 분석(SSCP), 미세부수체 염기서열 분석, SNP(단일염기 다형성) 분석, 유전자 돌연변이 검출, HLA 매칭, 친자확인 및 법의학 분야에서는 세그먼트 PCR, RT-PCR(정량적 PCR) 등의 분석도 기존의 DNA 염기서열 분석에 활용할 수 있습니다. 미생물 및 바이러스의 개별검사, 유형별 판별 및 동정 등
시약 및 장비
1. BigDye Sequencing Reaction Kit의 주요 시약은 PE 특허의 4색 형광 표지 ddNTP와 일반 dNTP, AmpliTaq DNA
polymerase FS, 반응 완충액 등이 포함된 BigDye Mix입니다.
2. pGEM-3Zf( ) 이중 가닥 DNA 대조 템플릿 0.2g/L, 키트 지원 시약.
3． M13(-21) 프라이머 TGTAAAACGACGGCCAGT, 3.2μmol/L, 즉 3.2pmol/μl, 키트의 보조 시약.
4. DNA 염기서열 분석 템플릿
은 PCR 산물, 단일 가닥 DNA, 플라스미드 DNA 등이 될 수 있습니다. PCR 반응 중에는 template 농도를 1 μl로 조정해야 합니다.
본 실험에서 측정된 플라스미드 DNA의 농도는 0.2g/L, 즉 200ng/μl입니다.
5. 프라이머
측정하려는 DNA 단편에 따라 정방향 또는 역방향 프라이머를 설계하고 3.2μmol/L, 즉 3.2pmol/μl로 준비해야 합니다. 재조합 플라스미드에 범용 프라이머 서열이 포함되어 있는 경우 M13(-21) 프라이머, T7 프라이머 등과 같은 범용 프라이머도 사용할 수 있습니다.
6. 멸균된 탈이온수 또는 삼중 증류수.
7. 0.2ml 또는 0.5ml PCR 튜브캡과 별도로 PE사 제품입니다.
8.3mol/L 아세트산나트륨(pH5.2) NaAc·3H2O 40.8g을 달아 증류수 70ml에 녹이고, 빙초산으로 pH를 5.2로 맞춘 후 100ml로 조절하고 고압증기멸균한다. 포장하기 전에.
9.70 에탄올 및 무수 에탄올.
10． NaAc/에탄올 혼합액: 무수에탄올 37.5ml와 3mol/L NaAc 2.5ml를 넣고 잘 섞은 후 실온에서 1년간 보관할 수 있습니다.
11. POP 6 시퀀싱 젤 ABI 제품.
12. 템플릿 억제 시약(TSR) ABI 제품.
13. 10× 전기영동 완충액 ABI 제품.
14． ABI PRISM 310 완전 자동 DNA 시퀀서.
15. 2400 또는 9600 PCR 장비.
16. 탁상형 냉장 고속 원심분리기.
17. 벤치탑 고속 원심분리기 또는 포켓 원심분리기.
작업 단계
1. PCR 시퀀싱 반응
(1) 0.2ml PCR 튜브를 가져와 마커로 번호를 매긴 후 과립 얼음에 튜브를 삽입하고 다음 표에 따라 시약을 추가합니다.
결정 첨가된 시약의 템플릿 튜브 표준 대조 튜브
BigDye Mix 1μl 1μl
테스트할 플라스미드 DNA 1μl -
pGEM-3Zf ( ) 이중 가닥 DNA - 1μl
검사할 DNA의 정방향 프라이머 1μl -
M13(-21) 프라이머 - 1μl
멸균된 탈이온수 2μl 2μl
Total 반응량은 5 μl입니다. 경미한 미네랄 오일이나 파라핀 오일을 첨가하지 마십시오. PCR 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 튜브를 손가락으로 가볍게 두드려 섞은 후 가볍게 원심분리하십시오.
(2) 증폭을 위해 PCR 튜브를 9600 또는 2400 PCR 기계에 놓습니다. 98°C에서 2분 동안 변성시킨 후 PCR 사이클 매개변수를 96°C에서 10초, 60°C에서 4분으로 증폭 후 설정합니다. 배양을 위해 온도를 4°C로 높입니다.
2. 아세트산나트륨/에탄올 방법에 의한 PCR 산물 정제
(1) 혼합물을 원심분리하고 증폭 산물을 1.5ml EP 튜브로 옮깁니다.
(2) 25μl의 아세트산나트륨/에탄올 혼합물을 첨가하고 잘 흔든 다음 얼음 위에 10분간 놓아 DNA를 침전시킵니다. 12,000r/min, 4°C에서 30분간 원심분리한 후 상청액을 조심스럽게 버린다.
(3) 70(V/V) 에탄올 50μl를 첨가하여 펠릿을 두 번 세척합니다. 4°C에서 5분 동안 12,000r/min으로 원심분리합니다. 튜브 벽에 있는 상등액과 액체 비드를 조심스럽게 버리고 침전물을 10~15분 동안 진공 건조합니다.
3． 전기영동 전 PCR 산물의 시퀀싱 처리.
(1) TSR 12μl를 원심분리 튜브에 넣고 세게 흔들어 DNA 침전물을 완전히 용해시킨 후 짧게 원심분리합니다.
(2) 뚜껑을 분리한 0.2ml PCR 튜브에 용액을 옮기고 살짝 원심분리합니다.
(3) PCR 기계에서 열 변성(95°C, 2분간)을 수행하고 얼음에 담금질한 후 기계에서 사용할 때까지 기다립니다.
4. 기계 작동
기기 작동 지침에 따라 모세관을 설치하고 모세관 위치를 수정한 다음 수동으로 젤을 채우고 실행을 위한 시퀀싱 시퀀스 파일을 설정합니다.
장비는 자동으로 겔을 모세관에 채우고, 1.2kV에서 5분간 사전 전기영동을 수행하고, 프로그래밍된 순서에 따라 자동으로 샘플을 주입한 다음 사전 전기영동(1.2kV, 20분), 7.5kV에서 2시간 동안 전기영동을 수행합니다. . 전기영동 후 기기는 자동으로 세척, 젤 채우기, 다음 샘플 입력, 사전 전기영동 및 전기영동을 수행합니다. 각 샘플의 총 전기영동 시간은 2.5시간이었습니다. 전기영동 후 기기는 색상 순서 맵을 자동으로 분석하거나 인쇄합니다.
5. 기기는 자동으로 서열 분석을 수행하고 사용자 요구 사항에 따라 서열 비교를 수행할 수 있습니다. 염기서열 분석 순서를 알고 있는 경우 염기서열 비교를 통해 차이가 있는 염기를 별표로 표시하여 작업 효율성을 높일 수 있습니다.
6. 시퀀싱 후에는 기기 작동 절차에 따라 기기를 청소하고 유지관리합니다.
계산
시퀀싱 반응 정확도 계산 공식: 100 - 차이 염기 수(N 수 제외)/650×100
차이 염기가 결정됩니다 DNA 서열은 알려진 표준 DNA 서열과 다르며, N은 기기로 읽을 수 없는 염기입니다.
참고 및 의견
1. ABI PRISM 310 유전자 분석기는 운영, 관리 및 유지 관리에 전담 인력이 필요한 고급 정밀 기기입니다.
2. 본 실험에서 시퀀싱 PCR 반응의 총 부피는 5 μl이며, 미네랄 오일로 덮여 있지 않으므로 시약을 첨가한 후 PCR 튜브 커버를 단단히 조이는 것 외에도 PCR 튜브 커버를 밀봉하는 것이 매우 중요합니다. PE 회사의 PCR 튜브를 사용하는 것이 가장 좋습니다. PCR 완료 후 PCR 용액이 4~4.5 μl 미만인 경우 PCR 반응이 실패할 수 있으며, 정제 및 로딩이 필요하지 않습니다.
3． 시퀀싱 사용자는 정제된 DNA 샘플과 프라이머만 제공하면 됩니다. 시퀀싱 PCR 반응에는 다양한 템플릿이 사용되며, PCR 시퀀싱에 필요한 DNA 양도 다릅니다. PCR 제품은 30~90ng, 단일 가닥 DNA는 50-100ng, 이중 가닥 DNA는 200-500ng가 필요합니다. DNA의 순도는 일반적으로 A260nm/A280nm가 1.6-2.0입니다. DNA를 탈이온수 또는 삼중으로 녹이는 것이 가장 좋습니다. TE 완충액 대신 증류수. 3.2 pmol/μl의 프라이머를 준비하려면 탈이온수나 삼중 증류수를 사용하는 것이 좋습니다.
4. 본 실험에 사용된 Sequencing Kit는 BigDye Fluorescent Labeled Termination Substrate Cycle Sequencing Kit로 일반적으로 약 650bp 정도의 DNA 길이를 측정할 수 있습니다. 본 장비의 DNA 시퀀싱 정확도는 (98.5±0.5)입니다.
장비로 판독할 수 없는 염기가 N<2이고 필요한 길이가 650bp를 초과하는 경우 추가 프라이머 설계가 필요합니다. 보다 정확한 시퀀싱을 보장하기 위해 상호 확인을 위해 동일한 템플릿을 시퀀싱하도록 역방향 프라이머를 설계할 수 있습니다. N 염기는 수동으로 확인할 수 있으며 때로는 읽을 수도 있습니다. 시퀀싱의 정확성을 높이기 위해 별표로 표시된 위치에 따라 컬러 맵을 수동으로 분석하여 베이스를 추가로 확인할 수 있습니다.
구체적인 구성 방법은 구입하는 제품 설명서에서 확인할 수 있으며 대부분의 실험실에는 관련 공식이 있습니다.