형광 편광 방법을 사용하여 IgG 및 Fc 세그먼트 함유 유도체를 빠르고 정확하며 높은 처리량으로 검출합니다.

형광 편광 방법을 사용하여 IgG 및 Fc 세그먼트 함유 유도체의 빠르고 정확하며 처리량이 높은 검출

Carolanne Doherty 박사

Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland

BMG 다기능 마이크로플레이트 리더는 IgG 정량을 위한 신기술 Valita® TITER에 적용할 수 있습니다. 이 제품은 형광 편광 방법을 사용하여 세포 배양 상청액에서 IgG를 직접 검출합니다. >

마이크로플레이트 리더 사전 설정 감지 프로그램 및 데이터 분석 템플릿은 연구 속도를 높입니다.

소개

대부분의 치료제 개발 및 항체 생산에서 정확하고 신속하며 처리량이 높은 IgG를 감지합니다. 단일클론 항체는 바이오의약품 분야에서 두각을 나타내고 있으며, 추가 개발을 위해 수많은 샘플이 검사를 기다리고 있습니다. 여기에서는 세포 배양 상청액에서 IgG를 직접 정량화하기 위한 새로운 스크리닝 기술인 Valita®TITER를 소개합니다.

단백질 A 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC 단백질 A), ELISA 기술, 단백질 A 표면 간섭법, HTRF(균질 시간 분해 형광법) 등 기존 기술은 모두 가격 등 명백한 단점을 갖고 있습니다. 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 시간이 많이 걸립니다.

Valita® TITER 방법은 IgG를 검출하는 새롭고 매우 정확하며 저렴한 방법으로 검출 범위는 2.5-80mg/L입니다. Valita® TITER는 형광 편광 기술을 사용하여 IgG의 Fc 세그먼트와 단백질 G의 결합을 감지합니다(그림 1). 분석은 간단하고 처리량이 높으며 빠르며 자동화할 수 있는 96웰 플레이트에서 수행됩니다. 매우 적은 양의 세포 배양 배지에서 지루한 준비 없이 분석을 수행할 수 있습니다.

이 애플리케이션 노트에서는 PHERAstar®, POLARstar® Omega 및 CLARIOstar®에서 Valita® TITER 키트를 사용하여 IgG를 정량적으로 검출하는 프로토콜을 소개합니다.

형광 편광은 분자 크기의 변화를 효과적으로 분석할 수 있습니다. "고정" 형광단은 편광에 의해 여기될 때 여기광과 동일한 편광 방향으로 형광을 방출합니다. 그러나 회전하는 형광단의 형광 편광 방향은 여기광의 편광 방향에 비해 어느 정도 변경됩니다. 용액에서 작은 분자는 큰 분자보다 빠르게 회전합니다. 따라서 형광 그룹에 연결된 분자 크기의 변화는 형광 탈분극 정도를 통해 측정할 수 있습니다. 따라서 형광 표지된 단백질 G가 다른 분자에 결합하지 않으면 더 빠르게 회전하고 더 많이 탈분극되는 반면, IgG에 결합하면 반대 현상이 발생합니다(5배 더 커짐)(그림 2). 이러한 극성 변화는 용액에서 IgG를 검출하는 데 사용됩니다. 형광 편광(FP)은 평행 편광 방향의 여기광을 용액에 조명하고 방출된 형광을 평행 및 수직 방향으로 측정하여 수행됩니다. FP는 일반적으로 mP로 표시되는 두 가지 편광 형광 사이의 표준화된 차이입니다.

재료 및 방법

Valita® TITER 분석 키트

Valita® TITER APP 소프트웨어(키트에 제공)

IgG 표준 제품 (인간 혈청에서 얻은 IgG)

PHERAstar, POLARstar Omega 및 CLARIOstar 다기능 마이크로플레이트 판독기(BMG LABTECH)

실험 과정

샘플 준비 적절한 지침을 따르세요. 키트 지침의 요구 사항. 표준곡선은 각 상대형광값이 IgG 표준에 해당하는 방법을 사용하여 그려집니다. Valta® TITER 마이크로플레이트의 각 웰에 재구성 완충액 60μl와 표준물질 또는 샘플 60μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 POLARstar Omega, PHERAstar 또는 CLARIOstar 다기능 마이크로플레이트 리더(BMG LABTECH Company)에서 판독하기 위해 사전 설정된 감지 프로그램을 사용합니다(매개변수 설정은 아래 표 참조). 획득한 Raw Data를 MARS 분석 소프트웨어에서 .csv 형식 파일로 변환한 후 Valita APP 소프트웨어를 사용하여 분석하세요.

기기 설정

결과 및 토론

그림 3의 표준 곡선(2.5-80mg/L)은 형광 편광 검출 기능을 갖춘 BMG LABTECH Company에서 얻은 것입니다. 다기능 마이크로플레이트 판독기(POLARstar Omega, CLARIOstar 및 PHERAstar)에서 Valita® TITER 키트를 사용하여 플롯되었습니다. 모든 마이크로플레이트 리더에서 얻은 결과는 매우 안정적입니다.

마지막으로 Valita® TITER를 사용한 IgG 정량 결과와 기존 방법을 사용한 HPLC 결과를 비교하기 위해 다양한 조건에서 배양된 샘플을 사용했습니다. 그림 4는 두 방법의 측정 결과의 상관관계를 보여주며, 두 정량 방법 모두 정확도가 좋고, Valita® TITER 분석은 지루한 시료 준비 과정이 필요하지 않기 때문에 더 빠릅니다.

결론

혼합 시료의 신속한 IgG 농도 측정은 이러한 바이오의약품의 개발 및 생산에 매우 중요합니다. 여기에서는 형광 편광 방법인 Valita® TITER 분석 방법을 기반으로 IgG 및 Fc 세그먼트 유도체의 빠르고 간단한 고처리량 측정을 위한 새로운 기술을 소개합니다. Valita® TITER 분석은 번거로운 시료 준비나 정제 과정 없이 테스트할 시료의 IgG를 직접 정량화할 수 있습니다. CLARIOstar, PHERAstar 및 POLARstar Omega는 Valita® TITER 분석에 사용될 때 탁월한 성능을 제공합니다. 다른 IgG 정량 분석 편의성과 비교하여 Valita® TITER는 높은 처리량, 단순성, 정확성 및 속도라는 특징을 가지고 있습니다.