1..1? 1 분자 마커
1..1..1? RFLP 태그 기술.
Botesin 이 1980 에서 제안한 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 은 유전자 마커로 DNA 다형성이 직접 적용되는 새로운 단계를 만들어 최초의 분자 마킹 기술입니다. RFLP 는 제한 내체효소 소화 후 형성된 특정 DNA 조각의 크기로 DNA 분자에 다른 제한 부위의 분포를 반영한다. 따라서 DNA 서열의 미세한 변화, 심지어 65,438+0 개의 뉴클레오티드 변화도 제한적인 내체효소 절단 부위의 손실이나 발생을 초래하여 제한적인 내체효소 조각 길이의 변화를 초래할 수 있다.
장점: RFLP 마크의 등위 유전자는 * * * 명백한 특징을 가지고 있으며, 결과는 안정적이고, 반복성이 뛰어나며, 특히 유전 연쇄도를 구축하는 데 적합하다.
단점: RFLP 분석에서 이 지점의 DNA 조각이 프로브로 필요한데 방사성 동위원소와 핵산 잡교 기술은 안전하지 않고 자동화하기 쉽지 않다. 또한 RFLP 는 DNA 다형성 검출에 민감하지 않으며 RFLP 연쇄도에는 많은 큰 공간 영역이 있습니다.
1..1.2? RAPD 마킹 기술.
RFLP 기술의 단점을 극복하기 위해 윌리엄스는 1990 에 무작위 증폭 다형성 DNA (RAPD) 기술을 구축했다. RAPD 기술은 DNA 다형성을 검출하는 독특한 방법으로 유전자 연구의 모든 분야에 빠르게 침투했다. RAPD 는 PCR 기반 분자 마킹 기술입니다. 기본 원리는 무작위 프라이머 (8 ~ 10 염기) 로 PCR 반응을 통해 DNA 조각을 무작위로 증폭시킨 다음 젤 전기 영동으로 증강조각을 분리하여 DNA 다형성을 연구하는 것이다. 어떤 특정한 유인물에 대해서도 게놈 DNA 서열에 특정한 결합점이 있다. 일단 게놈이 이 이 지역에 DNA 조각을 삽입, 누락 또는 염기돌연변이를 일으키면, 이러한 특이성 결합부위의 분포가 변경되어 증강산물의 수와 크기가 변하여 다태성을 나타낼 수 있다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 유전명언)
장점: RFLP 에 비해 RAPD 기술은 간단하고, 탐지가 빠르고, DNA 소비가 적고, 실험 장비가 간단하고, DNA 프로브가 필요하지 않으며, 유인물을 설계할 때 사전 복제, 표시 또는 서열 분석이 필요하지 않으며, 종 특이성과 게놈 구조의 영향을 받지 않습니다. 합성 프라이머 세트는 다른 생물의 게놈 분석에 사용될 수 있으며, 프라이머는 동위 원소를 필요로하지 않고 여러 조각을 증폭시킬 수 있으며 안전합니다.
단점: 물론 RAPD 기술은 여러 가지 요인에 의해 영향을 받으며 실험의 안정성과 반복성이 떨어집니다. 첫 번째는 우성 유전으로, 잡합 부위를 식별할 수 없어 유전 분석이 비교적 복잡하다. 유전자지도 작성 및 연쇄 유전지도 작성에서, 우성 커버리지로 인해 유전자좌 사이의 유전 거리를 계산하는 정확도는 특이성과 게놈 구조에 속한다. 한 세트의 유인물은 서로 다른 생물의 게놈 분석에 사용될 수 있으며, 하나의 유인물은 여러 조각을 증폭시킬 수 있으며 동위원소, 안전도 필요하지 않다. 물론, RAPD 기술은 여러 가지 요인에 의해 영향을 받고 있으며, 실험의 안정성과 반복성이 떨어진다. 첫 번째는 우성 유전으로, 잡합 부위를 식별할 수 없어 유전 분석이 비교적 복잡하다. 유전자지도와 연쇄 유전지도를 할 때, 우성 커버리지로 인해 유전자좌 사이의 유전 거리를 계산하는 정확도가 떨어진다. 둘째, RAPD 는 템플릿 농도와 Mg2+ 농도를 포함하여 반응 조건에 매우 민감하므로 실험의 반복성이 떨어집니다.
1.3? AFLP 태깅 기술
-응? 증폭 단편 길이 다형성 (AFLP) 은 선택적인 제한 조각 증폭 2 (SRFA) 라고도 하며 네덜란드 키겐의 Zabean 과 Vos 가 1993 년에 발명해 특허를 출원했다. AFLP 는 최근 몇 년 동안 급속히 발전한 분자 마킹 기술이다. 게놈 DNA 를 한 쌍의 제한 내체효소로 소화한 단편을 하나의 커넥터 (제한 부위와 보완) 에 연결하고 5' 끝과 커넥터가 보완되는 반특이성 프라이머를 통해 대량의 DNA 조각을 증폭시켜 지문을 형성하는 분자 마킹 기술을 형성한다. AFLP 지문은 멘델의 우성과 보이지 않는 유전이다.
장점: RAPD 와 RFLP 의 장점을 모두 갖추고 있어 안정성이 높습니다. 소량의 선택적 프라이머를 사용하면 짧은 시간 내에 대량의 유전자좌를 감지할 수 있으며, 각 프라이머에서 감지된 많은 유전자좌는 여러 염색체에 무작위로 분포되어 있다. 각 염색체의 AFLP 마커 수는 염색체 길이와 양의 상관 관계가 있습니다 (r = 0). 50 1) 반면 한 쌍의 유인물에 관련된 염색체 수는 마커 수 (r = 0) 와 양의 상관 관계가 있습니다. 따라서 소량의 효율적인 프라이머 조합을 통해 전체 게놈을 덮는 AFLP 마크를 얻을 수 있습니다. 현재 AFLP 는 효율적인 지문 기술로서 유전육종 연구에서 그 장점을 발휘하고 있다.
단점: 그러나 AFLP 가 게놈 순도와 반응 조건에 대한 요구가 높다는 연구도 있다. 또한, 유전지도에 사용될 때, 소수의 표기는 지도와는 밀접한 정도가 다르다. 또한 RAPD 및 RFLP 기술을 기반으로 scar (시퀀스 특성화 증폭 영역), caps (분해 증폭 다형성 시퀀스) 및 daf (DNA am 2 증폭 지문) 가 설정되었습니다. 이들 기술의 출현은 1 대분자 표기 기술을 더욱 풍부하게 보완하여 DNA 다태성에 대한 연구 수단을 증가시켰다.
1.2? 2 세대 분자 마커
2. 1? SSR 태깅 기술.
진핵 생물 게놈에는 반복 단위 길이가 15 ~ 65 개 뉴클레오티드인 마이크로위성 DNA (반복 단위 길이가 2 ~ 6 개 뉴클레오티드인 작은 위성 DNA) 와 같은 비코딩 반복 시퀀스가 많이 있습니다. 마이크로위성과 마이크로위성 DNA 는 전체 게놈의 다른 부위에 분포되어 있다. 반복 단위의 크기와 순서가 다르기 때문에 복제 수도 달라 풍부한 길이 다형성을 이루고 있다. 무어는 199 1 년 PCR 기술과 결합하여 SSR (단순 시퀀스 반복) 마킹 기술을 만들었습니다. SSR (Microsatellite DNA 라고도 함) 은 여러 모델 (대부분 1 ~ 5) 의 직렬 반복으로 구성된 DNA 시퀀스이며, 가장 일반적인 것은 디 뉴클레오티드 반복 시퀀스, 즉 (CA) n 과 (TG) N, 각 마이크로위성 DNA 의 핵심이다. 다른 유전 물질의 반복 횟수가 다르면 SSR 길이의 높은 변동성이 발생합니다. 이는 SSR 마크의 기초입니다. SSR 마크의 기본 원리: 마이크로위성 반복 시퀀스의 양끝에 있는 특정 짧은 시퀀스 설계 프라이머에 따라 PCR 반응을 통해 마이크로위성 세그먼트를 증폭시킵니다. 핵심 서열의 반복 횟수가 다르기 때문에 길이가 다른 PCR 산물을 증폭시키는 것은 DNA 다형성을 감지하는 효과적인 방법이다. 마이크로위성 서열은 고도의 다태성을 가지고 있으며, 집단에서 * * * 우성을 가지고 있으며, 좋은 분자 표시이다. 현재 마이크로위성 마크는 인간, 쥐, 쥐, 벼, 밀, 옥수수 등 종의 염색체 유전지도를 구축하는 데 사용되고 있다.
장점: 이러한 마이크로위성 표시는 유전자 위치 확인 및 복제, 질병 진단, 유전 분석 또는 품종 감정, 작물 육종, 진화 연구 등에 널리 사용되고 있습니다. 또한 SSR 마크는 순합자와 잡합자를 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 결과가 더욱 믿을 만하고, 방법이 간단하며, 시간과 노력을 절약할 수 있다.
2.2? ISSR 태깅 기술.
ISSR 은 새로운 분자 마커 기술입니다. 1994 년, Zietkiewicz 는 SSR 기술을 발전시켜 앵커 마이크로위성 과뉴클레오티드 기술을 구축했다. 그들은 앵커 마이크로 위성 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용합니다. 즉, SSR 의 5' 끝 또는 3' 끝에 무작위로 선택된 뉴클레오티드를 2 ~ 4 개 추가하면 특정 부위의 어닐링을 일으킬 수 있으며, 이로 인해 앵커 프라이머와 보완되는 반복 시퀀스 사이의 게놈 세그먼트의 PCR 증폭이 발생합니다. 이 표시를 ISSR 이라고도 합니다
시퀀스 반복), assr (앵커 단순 시퀀스 반복) 또는 AMP2PCR. 사용된 쌍익 프라이머 중 하나는 ASSR 프라이머이고 다른 하나는 무작위 프라이머일 수 있습니다. 하나는 5' 끝에 앵커가 있는 ASSR 프라이머이고 다른 하나는 RAMP 기술 [19] 이라고 하는 무작위 프라이머입니다. ISSR2PCR 증폭에 사용되는 프라이머는 일반적으로 16 ~ 18 염기 시퀀스로, 1 ~ 4 염기 연결 반복 시퀀스와 여러 개의 비반복 앵커 염기로 구성되어 있어 프라이머와 게놈 DNA 의 SSR 5 를 보장합니다.
장점: SSR 은 진핵생물에 분포가 매우 보편적이며 진화와 돌연변이가 매우 빠르기 때문에 닻을 붙인 ISSR2PCR 은 게놈의 많은 부위의 차이를 감지할 수 있다. ISSR-2 PCR 에 비해 ISSR-2PCR 이 사용하는 프라이머는 DNA 시퀀싱을 미리 할 필요가 없습니다. 따라서 일부 ISSR 프라이머는 특정 게놈 DNA 에 페어링 영역이 없을 수도 있고, 증강생성물이 없을 수도 있습니다. 일반적으로 명시적 표시, 멘델 유전, 안정성과 다형성이 우수합니다.
1.3? 3 세대 분자 마커
3. 1? SNP 마킹 기술.
단일 뉴클레오티드 다형성 (단일 뉴클레오티드? 다형성, SNP) 는 3 세대 DNA 분자 표지라고 불리며, 같은 부위의 서로 다른 대립유전자 사이에 있는 단일 뉴클레오티드의 차이를 말하며, 단일 염기의 누락이나 삽입을 포함하여 단일 뉴클레오티드의 교체가 더 흔하며, 종종 퓨린 염기 (A 와 G) 와 피리 미딘 염기 (C 와 T) 사이에서 발생한다. SNP 마커는 두 개체 간의 유전 물질 차이를 구별하는 데 도움이 되며 가장 유망한 유전 마커로 간주됩니다. 현재 인간 염색체에 2,000 여 개의 마크를 배치하고 있으며, 의남 교에서 236 개의 SNP 마크를 개발했다. 약 30% 의 SNP 마커에는 제한 부위의 다형성이 포함되어 있습니다.
장점: SNP 를 감지하는 가장 좋은 방법은 DNA 칩 기술이다. 최근 보도된 마이크로칩 전기 수영은 임상 샘플 중 SNP 를 고속으로 감지할 수 있으며 모세관 전기 영동과 평면 전기 영동보다 각각 10 과 50 배 빠르다. SNP 는 1 세대의 RFLP 와 2 세대 SSR 의 두 가지 차이점이 있습니다. 첫째, SNP 는 더 이상 DNA 세그먼트의 길이 변화를 감지 수단으로 사용하지 않고 직렬 변이를 직접 표시한다는 것입니다. 둘째, SNP 마크 분석은 고전적인 젤 전기 영동을 완전히 버리고 최신 DNA 칩 기술로 대체했다.
3.2? EST 마크 업 기술.
표현 서열 라벨 (EST) 은 미국 국립보건연구원 (NIH) 의 생물학자 Venter 가 199 1 에서 제안한 것이다. 인간 게놈 프로젝트가 진행됨에 따라 EST 기술은 새로운 인간 유전자 발견, 인간 게놈 지도 작성, 게놈 서열 코딩 영역 식별 등 연구 분야에 광범위하게 적용돼 식물 게놈 연구에 널리 사용되고 있다. EST 는 다른 조직의 cDNA 문고에서 무작위로 복제 서열을 해독하여 일부 cDNA 서열을 얻는 것을 말한다. EST 는 mRNA 의 cDNA 복제 시퀀스에 해당하며 길이는 일반적으로 150 ~ 500 BP 로 유전자 인코딩 영역만 포함합니다.
장점: EST 는 특정 시점의 유기체 표현 유전자를 대표할 수 있어' 표현 서열 감정' 이라고 불린다. 그러나 ESTs 의 수는 그것이 나타내는 유전자의 사본 수를 보여준다. 유전자 발현 횟수가 많을수록 cDNA 복제가 많아집니다. 따라서 cDNA 복제를 시퀀싱하고 분석하여 유전자 표현의 풍도를 알 수 있다. 현재, cDNA 라이브러리를 구축 하는 데 일반적으로 사용 되는 테스트 키트, DNA 시퀀싱 기술의 급속 한 발전은 더 많은 대규모 DNA 시퀀싱의 비용을 줄일 수 있습니다.