인산화 수식은 중요한 단백질 화학 수식으로 단백질을 완성하거나 바꾸는 기능에 중요한 역할을 한다. 이 분야에는 많은 기술적 어려움이 있어서 이 분야에 도전을 제기하였다. 최근 몇 년 동안 관련 기술은 많은 돌파구를 만들었고 인산화 연구도 많은 새로운 성과를 거두었다. 이 글은 인산화 단백질의 검출, 인산화 단백질과 텅스텐의 농축, 바이오매스 기술의 개선, 인산화 단백질과 텅스텐의 정량과 비교를 소개한다. 인산화 단백질과 인산화 펩타이드의 생물질량 분석법은 생명활동과 단백질의 동적 변화와 밀접한 관련이 있다. 대부분의 경우 일부 단백질의 절대 양은 크게 변하지 않지만, 그 기능은 다양한 번역 후 수정을 통해 완성되거나 변경될 수 있습니다. 인산화는 단백질의 대량의 번역 후 수식에서 매우 중요한 종류로, 오늘 발견된 모든 단백질의 30% 이상이 인산화될 수 있다. 단백질의 인산화 변형은 DNA 손상 복구 [1], 전사 조절 [2], 신호전도 [3], 시들어가는 조절 [4] 과 같은 많은 생물학적 과정과 밀접한 관련이 있다. 인산화 단백질과 텅스텐에 대한 연구는 우리가 상술한 과정의 이치를 밝히고 생명활동의 본질을 더 잘 이해하는 데 도움이 된다. 최근 몇 년 동안, 많은 관련 신기술과 새로운 방법이 끊임없이 생겨나 이 분야의 연구 진전을 추진하였다. 1 인산화 단백질의 검출은 현재 단백질에 대한 연구의 대부분이 전기 영동에 기반을 두고 있으며, 젤에 인산화 단백질 반점의 검출은 중요한 부분이다. 초기 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 방법은 32P 로 표시된 인산염을 세포에 대사해 이용한다. 세포 내 인산화단백질은 32P 의 방사능을 가지고 있으며, 전기 수영 후 [5] 을 감지할 수 있다. 이 방법은 대량의 방사성 물질을 접촉해야 하며 배양된 세포에만 적용될 수 있기 때문에 점차 도태되고 있다. 항인산화 단백질 항체 Western blot 검사는 특이성이 좋고 해상도가 높다는 장점을 가지고 있으며, 현재는 여전히 일반적인 방법 [6] 이다. 그러나 같은 젤을 사용하여 분석하고 준비할 수 없기 때문에 때때로 탐지된 단백질점이 젤에 대응하기 어려워 분석에 어려움을 겪기도 한다. Schulenberg 등 [7] 은 2003 년 소분자 형광 염료 Pro-Q Diamond dye 가 인산화 단백질을 특이하게 염색할 수 있다고 보도했다. 이 방법은 편리하고, 빠르고, 감도가 높으며, 스펙트럼 검진과 호환되며, 다른 염색 방법에 사용할 수 있다. Martin 등 [8] 일부 단백질과 폴리펩티드 조각을 여러 상업용 기판에 배열한 다음 프로-Q 다이아 염료를 사용하여 칩에 있는 단백질과 폴리펩티드의 인산화 수준을 365,438+02-625fg 로 측정했습니다. 이 칩과 고감도 검출 방법의 결합은 신호 통로와 인산효소 억제제를 연구하는 강력한 플랫폼을 제공한다. 형광 2 차원 차이 젤 전기 영동 (2D-DIGE) 은 2 차원 전기 영동에 기반한 형광 표지 단백질의 차이를 비교하는 기술로 매우 좋은 감지 감도를 가지고 있다. 또한 비교할 대상 단백질은 항상 같은 조건에서 단방향 및 양방향 전기 영동을 수행하며 같은 접착제에 전시되어 실험 오차로 인한 차이를 줄임으로써 비교 프로테옴 연구에 강력한 도구가 되었습니다. 인산화 단백질은 한 프로테옴의 극히 일부에 불과하며, DIGE 기술은 특정 표시를 할 수 없기 때문에 DIGE 기술은 인산화 단백질을 비교 분석하기가 어렵다. Seisuke 등 [9] 이 문제를 잘 해결했다. 그들은 실험에서 인산화 단백질을 이용하여 테스트 키트 농축 인산화 단백질을 농축한 다음, DIGE 기술을 이용하여 차이를 분석해 DIGE 기술의 적용 범위를 넓혔다. 2 인산화 단백질과 펩티드의 농축은 인산화 펩티드의 양이 비인산화 펩타이드 세그먼트에 비해 매우 적기 때문에 질량 분석법에서 다른 펩타이드 세그먼트에 의해 쉽게 덮이기 때문에 인산화 단백질 또는 펩타이드 세그먼트를 농축해야 확인하는 경우가 많습니다. 인산화 단백질과 펩타이드를 풍부하게하는 고전적인 방법에는 금속 이온 친화층 분석 (IMAC)[ 10], 바이오틴-친화소 농축 [1 1], 면역 침전 [/ 이러한 방법의 대부분은 색상 스펙트럼 기술을 기반으로 하며, 색상 스펙트럼 기둥 충전재의 성능은 농축 효과에 영향을 미치는 핵심 요소입니다. 2004 년에 Pinkse 등 [14] 은 TiO2 _ 2 필러로 직접 색보기둥을 만든 다음 이 기둥으로 인산화 단백질 PKG 의 산물을 분리했다. 온라인 ESI-MS/MS 분석 후 PKG 에는 적어도 8 개의 인산화 부위가 있고, 두 개의 새로운 인산화 부위인 Ser-26 과 Ser-44 가 발견됐다. Pinkse 등은 TiO2 충전재가 효율적이고 특이하게 인산화 펩타이드와 결합될 수 있다고 생각하여 인산화 펩타이드를 효과적으로 풍부하게 하여 좋은 응용 전망을 가지고 있다. 농축 후 역상주 탈염과 스펙트럼 감정으로 펩타이드를 확인하는 것은 일반적인 방법이지만 인산화 후 친수성이 되는 인산화 펩타이드와 같은 친수성 펩타이드를 확인하는 데는 효과가 좋지 않다. Larsen 등 [15] 역상 수지와 흑연충주가 인산화 펩타이드에 미치는 분리 효과를 비교한 결과, 후자가 인산화 펩타이드를 효과적으로 보존하고 인산화 펩타이드의 농축, 분리 및 식별에 더 적합하다고 판단했다. 인산화 플루토늄의 농축에 대해, 일부 학자들은 이미 친화충전제의 개선에만 초점을 맞추는 것이 아니다. Steven 등 [16] 은 트립신이 소화하는 플루토늄 세그먼트가 대부분 pH2.7 정도에서 양전하를 띠는 반면, 한 덩어리는 인산화 후 양전하를 띠는 것으로 밝혀졌다. 이 현상에 따르면 양전하를 띤 인산화 플루토늄 세그먼트는 강한 양이온 교환 스펙트럼을 통해 농축될 수 있다. 스티븐 등은 이런 방법으로 헬라 핵의 967 개 단백질 중 2,002 개의 인산화 부위를 식별해 지금까지 가장 큰 인산화 단백질 스펙트럼을 얻었다. 3 인산화 부위는 생체 질량 분석법에 의해 확인되었다. 인산화 부위는 1 급 스펙트럼과 직렬 스펙트럼을 결합하여 결정할 수 있다. 예를 들어, MALDI-TOF/TOF 초급 스펙트럼은 플루토늄 분자량의 이론값과는 80 Da (HPO3=80 Da) 차이가 나는 스펙트럼 피크를 찾을 수 있습니다. 이 피크의 2 차 스펙트럼에서는 모이온이 98 Da (중성 손실 H3PO4=98 Da) 인 경우 인산화 펩타이드 (그림 1) 로 확인할 수 있으며 2 차 또는 다단 스펙트럼을 더 통과할 수 있습니다. 또한 세린 (Serine) 과 트레오닌 (Therine) 의 인산화 잔기는 β-제거 반응을 통해 암모니아 에틸 알라닌으로 전환되며 라이신의 이성질체이다. 이 부위는 트립신, Lys-C 내반효소 등 효소 이성에 의해 인식되고 소화될 수 있으며 인산화 부위는 스펙트럼을 통해 쉽게 판단할 수 있다. 따라서 인산화 부위의 확인은 스펙트럼과 직렬 스펙트럼을 단순화하는 응용과 스펙트럼 감지 감도의 향상에 달려 있다. 최근 몇 년 동안 바이오매스 기술의 발전은 단백질 인산화 부위의 검사에 더 많은 선택적 기기와 방법을 제공하였다. 3. 1 푸리엽 변환 회전 공명 스펙트럼 (FT-ICRMS) T-ICRMS 는 지금까지 가장 정확한 스펙트럼, 해상도가 1~2 ppm 이상인 것으로 인산화점 분석에 적합합니다. 이온 캡처 해리 (ECD) 는 푸리에 변환 ICR 스펙트럼에 적용되는 기술로, 기존의 직렬 스펙트럼을 보완하는 기술이다. 이황키는 쉽게 열 수 있지만 ECD 가 망가질 때 번역 후 손질된 깨지기 쉬운 가격 키를 유지할 수 있어 번역 후 손질하는 연구에 적합하다. 그림 1 인산화 펩타이드 A 의 감정: MALDI-TOF/TOF 스펙트럼을 통한 효소 소화물의 1 차 스펙트럼입니다. 인산화 텅스텐의 스펙트럼 피크에는 별표가 표시되어 있으며, 비인산화 텅스텐에 비해 이론적 분자량은 80 Da (HPO3 = 80 Da) 이다. B: a 에서 별표로 표시된 스펙트럼 피크의 2 차 스펙트럼 분석도에서 모이온보다 98 Da (H3PO4 = 98 Da) 작은 중성 누락 피크를 볼 수 있습니다.
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