CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술 소개

CRISPR-Cas9은 ZFN, TALENs 및 기타 유전자 편집 기술이 도입된 후 3세대 유전자 편집 기술로 불과 몇 년 만에 전 세계적으로 인기를 끌었습니다. 이는 기존 유전자 편집 및 유전자 변형 기술 중 하나가 되었으며, 가장 효율적이고 단순하며 가장 저렴하고 사용하기 쉬운 기술 중 하나이며 오늘날 가장 주류를 이루는 유전자 편집 시스템이 되었습니다.

1. CRISPR-Cas 시스템이란

CRISPR-Cas 시스템은 원핵생물의 천연 면역체계입니다. 특정 박테리아는 바이러스에 침입한 후 바이러스 유전자의 작은 부분을 자신의 DNA에 있는 CRISPR라는 저장 공간에 저장할 수 있습니다. 바이러스 침입이 다시 발생하면 박테리아는 저장된 조각을 기반으로 바이러스를 식별하고 바이러스의 DNA를 잘라 무력화할 수 있습니다.

C RISPR-Cas 시스템은 CRISPR 유전자좌와 Cas 유전자(CRISPR 관련 유전자)의 두 부분으로 구성됩니다.

1. CRISPR(/'kr?sp?r/)은 원핵생물 게놈의 반복 서열입니다. CRISPR의 전체 이름은 Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats입니다. 서열화된 박테리아의 40%와 서열화된 고세균의 90%에 분포합니다. (참고: 심해 화산, 육지 온천, 염알칼리 호수 등 극한 환경에 서식하는 고세균이라는 독특한 구조를 가진 박테리아가 있습니다.)

CRISPR 유전자 서열은 주로 리더 서열(leader), 반복 서열(repeat), 스페이서 서열(spacer)로 구성된다.

① 리더 서열: AT 염기가 풍부하고 CRISPR 유전자의 상류에 위치하며 CRISPR 서열의 프로모터로 간주됩니다.

② 반복 서열: 길이는 약 20~50bp이고 5~7bp의 회문 서열을 포함합니다. 전사체는 헤어핀 구조를 형성하고 RNA의 전체 2차 구조를 안정화할 수 있습니다.

③ 스페이서 서열: 박테리아가 포획한 외래 DNA 서열이다. 이는 세균 면역 체계의 '블랙리스트'에 해당합니다. 이러한 외부 유전 물질이 다시 침입하면 CRISPR/Cas 시스템이 이를 정확하게 공격합니다.

2. Cas 유전자는 CRISPR 유전자 근처에 위치하거나 게놈의 다른 곳에 흩어져 있습니다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 CRISPR 서열 영역과 상호 작용할 수 있습니다. 따라서 해당 유전자를 CRISPR 연관 유전자(CRISPR Associated, Cas)로 명명하였다.

Cas 유전자에 의해 암호화된 Cas 단백질은 방어 과정에서 중요한 역할을 하며, 현재 Cas1-Cas10과 같은 여러 유형의 Cas 유전자가 발견되었습니다.

세균 면역 방어 과정에서 Cas 단백질의 역할에 따라 CRISPR-Cas 시스템은 현재 두 가지 주요 범주로 나뉩니다.

첫 번째 범주: 외인성 핵산 절단을 위한 효과 인자는 I형, III형 및 IV형을 포함한 여러 Cas 단백질로 형성된 복합체입니다.

두 번째 범주: 작용 인자는 유형 II Cas9 단백질 및 유형 V Cpf 단백질과 같은 상대적으로 단일 Cas 단백질입니다.

현재 가장 널리 사용되는 CRISPR 시스템은 Type II CRISPR-Cas 시스템인 CRISPR-Cas9 시스템입니다.

2. CRISPR-Cas9의 작동 원리

CRISPR-Cas9의 작동 메커니즘은 세 단계로 이해될 수 있습니다.

1. 첫 번째 단계: CRISPR의 가변성이 높은 스페이서 영역 획득(외부 DNA를 캡처하고 '블랙리스트' 등록)

CRISPR Acquisition의 가변성 스페이서 영역은 실제로 다음을 의미합니다. 외부 침입 파지 또는 플라스미드 DNA의 짧은 DNA 서열이 숙주 박테리아의 게놈에 통합됩니다. 통합 위치는 CRRSPR의 5' 말단에 있는 두 개의 반복 서열 사이에 있습니다. 따라서 CRISPR 유전자좌의 5'에서 3'까지의 스페이서 서열 배열은 외부 유전 물질 침입의 시간적 순서도 기록합니다.

새로운 스페이서 서열의 획득은 세 단계로 나눌 수 있습니다:

1단계: Cas1과 Cas2에 의해 암호화된 단백질은 침입한 DNA를 스캔하고 PAM 영역을 식별한 다음, PAM의 DNA 서열은 후보 프로토스페이서 서열의 역할을 합니다.

2단계: Cas1/2 단백질 복합체는 외래 DNA에서 프로토스페이서 서열을 절단하고, 다른 효소의 도움을 받아 CRISPR 서열에 인접한 리더 영역 하류에 프로토스페이서 서열을 삽입합니다.

3단계: 열린 이중 가닥 틈을 막기 위해 DNA가 복구됩니다. 이러한 방식으로 게놈의 CRISPR 서열에 새로운 스페이서 서열이 추가됩니다.

2. 두 번째 단계: CRISPR 유전자좌 발현(전사 및 전사 후 성숙 처리 포함)

CRISPR 서열은 리더 영역의 제어 하에 전사되어 pre를 생성합니다. -crRNA(crRNA) 전구체), pre-crRNA 서열에 상보적인 tracrRNA(transaactivate crRNA)도 전사됩니다. Pre-crRNA는 상보적인 염기쌍을 통해 tracrRNA와 이중 가닥 RNA를 형성하고 Cas9이 암호화하는 단백질과 복합체를 형성합니다. 침입자의 유형에 따라 해당 "ID 카드 번호"(스페이서 서열 RNA)를 선택하고 리보뉴클레아제 III(RNase III)의 도움으로 이 "ID 카드"를 잘라 최종적으로 짧은 crRNA를 형성합니다(단일 스페이서 서열 RNA의 유형 및 반복 서열 영역의 일부).

crRNA, Cas9 및 tracrRNA는 다음 절단 단계를 준비하기 위한 최종 복합체를 형성합니다.

3. 세 번째 단계: CRISPR/Cas 시스템 활성 활성화(표적 간섭)

crRNA, Cas9 및 tracrRNA로 구성된 최종 복합체는 유도 미사일과 같습니다. 침입자의 DNA에 대한 정확한 공격을 수행합니다. 이 복합체는 전체 외래 DNA 서열을 스캔하고 crRNA에 상보적인 프로토스페이서 서열을 식별합니다. 이때 복합체는 PAM/프로토스페이서 서열 영역에 위치하게 되고, DNA 이중가닥은 풀리면서 R-Loop를 형성하게 된다. crRNA는 상보적인 가닥에 혼성화되고 다른 가닥은 자유롭게 유지됩니다.

이어서, Cas9 단백질의 정확한 무딘 말단 절단 부위는 PAM의 3개 뉴클레오티드 상류에 위치하여 무딘 말단 생성물을 형성합니다.

Cas9 단백질의 HNH 도메인은 crRNA에 상보적인 DNA 가닥을 절단하는 역할을 담당하고, RuvC 도메인은 다른 비상보적 DNA 가닥을 절단하는 역할을 합니다. 마지막으로 Cas9의 작용으로 DNA 이중 가닥 절단(DSB)이 발생하고 외부 DNA의 발현이 침묵되며 침입자가 한 번에 제거됩니다.

3. CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술 및 응용…

tracrRNA-crRNA는 단일 가닥 가이드 RNA(sgRNA)에 융합되면 Cas9를 안내하는 역할도 할 수 있습니다. .

CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술은 인공적으로 설계된 sgRNA(가이드 RNA)를 사용하여 표적 게놈 서열을 식별하고 Cas9 프로테아제를 유도하여 DNA 이중 가닥을 효과적으로 절단하여 손상 후 이중 가닥 절단을 형성합니다. 유전자 녹아웃이나 녹인 등은 궁극적으로 게놈 DNA를 변형하는 목적을 달성합니다.

CRISPR-Cas9의 폭넓은 적용

1. 유전자 녹아웃(Knock-out)

Cas9는 표적 게놈을 절단하여 이중 DNA를 형성할 수 있습니다. . 정상적인 상황에서 세포는 손상된 DNA를 복구하기 위해 매우 효율적인 NHEJ(비상동 말단 접합)를 사용합니다. 그러나 복구 과정에서 흔히 염기 삽입이나 결실의 불일치가 발생하여 프레임시프트 돌연변이(Frameshift mutation)가 발생합니다. 일련의 다운스트림 코드 변경으로 인해 원래 특정 펩타이드 사슬을 암호화했던 유전자가 완전히 다른 펩타이드 사슬 서열로 변경되어 표적 유전자가 기능을 상실하게 되어 유전자 녹아웃이 달성됩니다. CRISPR 시스템의 특이성을 향상시키기 위해 Cas9의 한 도메인을 돌연변이시켜 DNA의 단일 가닥만 절단하여 DNA 닉을 생성할 수 있는 Cas9 닉카제 뉴클레아제를 형성할 수 있습니다. 따라서 이중 가닥 절단 효과를 생성하려는 경우 두 개의 sgRNA 서열을 설계하여 각각 DNA의 두 상보 가닥을 표적으로 삼을 수 있습니다. 이러한 방식으로 두 sgRNA는 표적 서열에 특이적으로 결합하여 DNA 절단을 형성할 수 있습니다. , 그리고 복구 과정 중 이동을 통해 DNA가 파손됩니다. 유전자 녹아웃을 달성하기 위해 돌연변이를 코딩합니다

2. 유전자 녹인(Knock-in)

DNA가 이중으로 가닥이 파손되면 DNA 복구 템플릿이 세포에 들어가면 게놈의 파손된 부분에 HDR(상동 재조합 복구)이 복구 템플릿을 기반으로 수행되어 유전자 녹인이 달성됩니다. 복구 템플릿은 가져올 표적 유전자와 표적 서열의 상동성 서열(상동성 암)로 구성됩니다. 상동성 암의 길이와 위치는 편집 서열의 크기에 따라 결정됩니다. DNA 복구 템플릿은 선형/이중 가닥 데옥시뉴클레오티드 가닥 또는 이중 가닥 DNA 플라스미드일 수 있습니다. HDR 복구 패턴은 세포에서 일반적으로 10 미만의 낮은 비율로 발생합니다. 유전자 녹인 성공률을 높이기 위해 현재 많은 과학자들이 HDR 효율을 개선하고, 편집된 세포를 HDR의 가장 활발한 세포 분열 기간에 동기화하고, HDR을 진행하는 복구 방법을 홍보하고 있습니다. HDR의 효율성을 높이기 위해 NHEJ에 대한 유전자를 억제하는 화학적 방법

3. 유전자 억제, 유전자 활성화(Repression or Activation)

Cas9의 특징은 독립적으로 결합하고 절단할 수 있다는 것입니다. Cas9의 두 가지 기능은 점 돌연변이를 통해 변형될 수 있습니다. RuvC- 및 HNH- 도메인은 비활성 상태이며, 생성된 dCas9는 sgRNA의 매개로 표적 유전자에만 결합할 수 있지만 다음과 같은 기능은 없습니다. DNA를 깎는다. 따라서 dCas9가 유전자의 전사 시작 부위에 결합하면 전사 시작이 차단될 수 있으며, 이에 따라 dCas9가 유전자의 프로모터 영역에 결합하면 전사 억제인자/활성화인자에도 결합하여 하류 표적 유전자의 전사가 억제될 수 있습니다. . 억제하거나 활성화합니다.

따라서 dCas9와 Cas9 및 Cas9 니카제의 차이점은 dCas9에 의한 활성화 또는 억제가 가역적이며 게놈 DNA에 영구적인 변화를 일으키지 않는다는 것입니다.

4. 다중 편집

여러 개의 sgRNA 플라스미드를 세포에 전달하면 여러 유전자를 동시에 편집할 수 있으며 이는 게놈 기능을 스크리닝하는 기능을 갖습니다. 다중 편집의 응용에는 이중 Cas9nickases를 사용하여 유전자 녹아웃, 대규모 게놈 삭제 및 다양한 유전자를 동시에 편집하는 정확도를 향상시키는 것이 포함됩니다. 일반적으로 다중 CRISPR 유전자 편집을 위해 하나의 플라스미드에 2~7개의 서로 다른 sgRNA를 구성할 수 있습니다.

5. 기능성 게놈 스크리닝

유전자 편집을 위해 CRISPR-Cas9를 사용하면 유전자 돌연변이 세포가 많이 생성될 수 있으므로 이러한 돌연변이 세포를 사용하여 표현형 변화 여부를 확인할 수 있습니다. 유전자에 의해 발생하거나 유전적 요인에 의해 발생합니다. 전통적인 게놈 스크리닝 방법은 shRNA 기술이지만, shRNA에는 오프 타겟(off-target) 효과가 높고 모든 유전자를 억제할 수 없어 위음성 결과가 나오는 한계가 있습니다. CRISRP-Cas9 시스템의 게놈 스크리닝 기능은 높은 특이성과 비가역성이라는 장점을 갖고 있어 게놈 스크리닝에 널리 활용되어 왔다. 현재 CRISPR의 게놈 스크리닝 기능을 활용해 화학요법 약물이나 독소 생성을 억제하는 유전자, 종양 이동에 영향을 미치는 유전자 등 표현형을 조절하는 관련 유전자를 스크리닝하고, 대규모 스크리닝을 위한 바이러스 스크리닝 라이브러리 구축에 활용하고 있다. 잠재적인 유전자.