순화 라벨은 당신이 관심 있는 단백질에 융합될 수 있는 알려진 단백질, 혹은 텅스텐이다. (존 F. 케네디, 단백질, 단백질, 단백질, 단백질, 단백질, 단백질, 단백질) 이 라벨들은 쉽게 식별할 수 있기 때문에 선택할 수 있는 많은 항체 들이 있어 쉽게 감지할 수 있다. 표기 방법은 주로 DNA 를 재조합하는 것이다. 관심 있는 단백질의 코드화 DNA 를 표식과 통합하여 입자를 세포로 옮기는 것이다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 건강명언) 플라스미드가 발현되면 융합 라벨이 단백질에 연결됩니다.
융합 레이블의 선택은 중요하며 연결구 시퀀스의 선택도 중요합니다. 커넥터 시퀀스는 단백질을 라벨에 연결하여 단백질이 제대로 접히고 정상 기능을 할 수 있도록 합니다.
왜 융합 라벨을 사용해야 합니까?
이점:
(1) 이 단백질에 대한 특이항체 없이도 분리된 단백질.
(2) 정제 후 필요한 경우 융합 라벨을 잘라야 한다.
(3) 여러 가지 목적으로 동일한 단백질에 여러 개의 표시를 부착할 수 있습니다.
(4) 면역 침전 중 항체 간섭을 피하십시오.
(5) 형광 마커는 살아있는 세포의 단백질을 관찰하는 데 사용될 수 있습니다.
단점:
(1) 일부 태그는 단백질의 기능에 영향을 줍니다.
(2) 태그 위치를 최적화해야 합니다.
이 글에서는 다양한 라벨만 소개하고 어떤 라벨을 어느 위치에 놓아야 하는지 말할 수 없습니다. 전적으로 당신의 실험 요구에 달려 있습니다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 스포츠명언)
라벨이 어디에 있는지 잘 모르겠다면, 프로테아제 부위 변경 또는 추가, 조인트 시퀀스 수정, 다른 목적에 여러 태그 추가와 같은 여러 가지 방안을 시도해야 합니다.
현재 다음과 같은 세 가지 주요 유형의 혼합 태그가 있습니다.
표위 라벨: 일반적으로 짧은 펩타이드 시퀀스로 WB, Co-IP 와 같은 면역 기술 응용에 사용할 수 있습니다.
친화라벨: 일반적으로 긴형으로 단백질 순화에 사용하거나 단백질의 용해도를 증가시키는 데 사용할 수 있습니다.
형광 표시: 살아있는 세포/죽은 세포에 사용할 수 있으며, 일반적으로 세포 위치 지정 및 * * * 표현 실험과 같은 이미징 실험에 사용됩니다.
이것은 전적으로 당신이 연구하고 싶은 단백질에 달려 있다: 단백질은 어떻게 접히는가? 어느 쪽 끝이 기능적입니까? 예를 들어, C 끝이 단백질 내부에 접히면 융합 라벨의 신호를 감지할 수 없습니다. 또는 번역 후 단백질이 한쪽 끝에서 잘릴 수 있습니다. 그러면 꼬리표도 잘릴 수 있습니다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 번역명언)
자신의 단백질이 어떻게 접혔는지 모르면 처음 할 때 C 끝과 N 끝 모두 시도해 보는 것이 좋습니다. 보도에 따르면 C- 말단 융합 단백질은 N- 말단 표기 융합 단백질보다 예상 세포 영역에 더 많이 위치한다고 한다. 하지만 완전히 그렇지는 않습니다.
모든 태그가 동일한 것은 아닙니다. 각 태그에는 고유한 용도와 한계가 있습니다. 예를 들어, 단백질을 더 쉽게 녹이고 라벨을 사용하여 정제해야 합니다. 직렬 친 화성 정제 (TAP). TAP 는 처음에 일련의 특정 도메인을 단백질로 융합하는 것을 가리킨다: 황금색 포도구균의 칼슘 결합펩타이드 (CBP) 와 단백질 A(ProtA) 는 담배 에칭 바이러스 (TEV) 의 절단 부위에 의해 분리되었다. 그러나 이 기술은 현재 2 ~ 3 개의 융합 라벨을 단백질에 융합하는 데 사용할 수 있지만, 일반적으로 여전히 TAP 원시 성분을 포함하고 있다. 이 라벨들은 단백질의 한쪽 끝이나 양쪽 끝에 융합될 수 있다. 사용 후 태그를 끊어야 하는 경우 일반적으로 태그를 연결하는 것이 좋습니다.
그의 라벨은 매우 작아서 정화 실험에 매우 효과적이기 때문에 TAP 에서 광범위하게 사용된다. 일반적으로 말토오스 결합 단백질 (MBP) 과 함께 사용되어 용해도를 높입니다. 또 다른 일반적인 조합은 GFP 와 His 입니다.
TAP 라벨은 많은 장점을 가지고 있지만 부피가 매우 커서 단백질의 기능을 손상시킬 수 있다. 또한 CBP 가 포함된 라벨을 사용하면 칼슘 신호를 방해할 수 있습니다. 그래서 단백질에 가능한 한 적은 라벨을 붙이세요.
일부 작은 라벨은 단백질의 기능에 거의 영향을 주지 않지만, 일부 큰 라벨은 예상치 못한 효과를 낼 수 있다. 이 경우, 너는 보통 라벨을 테스트한 후에 그것을 잘라야 한다. 이를 위해서는 특정 부위의 프로테아제 또는 펩타이드가 필요합니다.
사이트 특이성 단백질 효소는 이론적으로 너의 단백질 기능에 영향을 주지 않는다. 그러나 프로테아제는 보통 절단 후에 제거된다. 한 가지 해결책은 프로테아제와 라벨을 융합하여 친화층 분석을 통해 제거하는 것이다. 여러 프로테아제 인식 사이트의 선택은 당신의 요구에 달려 있습니다. 한 가지 주의해야 할 점은, 융합 라벨이 N 쪽에 있습니까, 아니면 C 쪽에 있습니까? N 끝에서 라벨을 자르면 잔기가 줄어들고 C 측에서 라벨을 자르면 단백질에 4 ~ 6 개 이상의 잔기가 남는다. 다음은 몇 가지 일반적으로 사용되는 프로테아제 사이트 목록입니다 (영문, 필요한 경우 직접 확인하시기 바랍니다).
친화라벨의 이름은 친화순화에 자주 사용되기 때문이다. 친화순화는 세포 분열물에서 단백질을 순화하는 기술이다. 다음 그림을 참조하십시오.
GST 는 분자 크기가 약 26KD 인 2 1 1 개 아미노산으로 구성된 단백질입니다. 천연 GST 는 유해한 성분과 산화 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있다. GST 는 트리펩티드와 글루타티온에 친화력이 있어 친화층 분석에 사용할 수 있는 것이 특징이다. GST 를 함유한 용액이 글루타티온이 고정된 기둥을 통과할 때 GST 는 글루타티온과 결합되어 용액으로부터 분리된다. 결합 후 10mM 글루타티온 세탁을 사용할 수 있습니다.
참고 사항:
(1) 오염: 열쇼크단백질은 때때로 GST 에 의해 씻겨진다. 너는 SDS-PAGE 접착제를 통해 이런 오염을 볼 수 있다. 열쇼크단백질의 오염을 제거하기 위해 순수화 전에 5mM 염화칼슘과 5mM ATP 로 세포분열액을 처리할 수 있다.
(2) 단백질 기능 상실: GST 는 큰 라벨이기 때문에 보통 이량 체로서 용액에 존재한다. 단백질 활성과 기능을 저하시킬 수 있습니다. 단백질 효소 (예: 트롬빈, 인자 Xa 또는 전면 절단) 를 사용하여 자를 수 있습니다.
PolyHis 라벨은 크기가 작고 결합이 안정적이어서 단백질 정제에 널리 쓰인다. His 태그에는 2- 10 개의 히스티딘 잔기가 있을 수 있지만 가장 일반적으로 사용되는 것은 6×His 태그 또는 hexatag 입니다. 그룹산은 고정된 과도금속이온과 배위 버튼을 형성하여 단백질 순화에 사용할 수 있다. 코발트와 아연 기둥은 고정 금속 친화색 스펙트럼 (IMAC) 에 사용할 수 있지만 일반적으로 니켈 기둥을 사용합니다. His 라벨은 짧은 펩타이드 서열이기 때문에 라벨의 최적 위치는 단백질 특이성에 달려 있으며 융합 단백질의 성질에 거의 영향을 미치지 않습니다.
참고 사항:
(1) 내원성 His: His 잔기는 포유류와 곤충에 광범위하게 존재하기 때문에 배경 신호가 높다. 5- 10mM 으로 세탁하면 배경 결합을 피할 수 있지만, 너무 일찍 단백질을 씻어낼 수 있다. 또한 His 항체 감지 시 배경 결합에도 주의해야 합니다.
(2) 금속 중심이 있는 단백질을 His-tag 에 융합하지 않는 것이 좋습니다. 금속은 친화수지에 흡착될 수 있기 때문입니다.
(3) 디설파이드 (DTT) 또는 베타-메르 캅토 에탄올과 같은 환원제는 수지의 친화력을 떨어뜨릴 수 있기 때문에 피해야 한다.
바이오틴은 일명 비타민 H 로 분자량이 244Da 인 작은 분자이다. 일반적으로 ELISA 및 WB 의 시각화 기술로 2 항제에 부착되어 있습니다. 바이오틴은 체인 곰팡이 친화소와 친화소 분자와 매우 강한 결합을 형성하여 친화순화에 사용할 수 있다. 바이오틴은 소분자이기 때문에 단백질의 기능에 영향을 주지 않는다. 또 다른 가치 있는 꼬리표는 연쇄상구균 꼬리표입니다. 길이가 8 아미노산 (WRHPQFGG) 이기 때문에 단백질의 기능에 영향을 주지 않고 같은 주머니에서 바이오틴과 가역적으로 결합된다. 이는 Strep-tag 와 융합된 단백질이 strptavidin 수지를 사용하여 효과적으로 순수화하고 온화한 완충 조건에서 바이오틴으로 씻을 수 있다는 것을 의미한다.
참고 사항:
(1) 사량 체 및 단량체의 친화수지: 바이오틴 포테이토 기둥은 바이오틴 마크의 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있으며 단백질은 사량 체 또는 단량체 형태로 사용할 수 있습니다. 사합체 abidin 색상 스펙트럼 기둥의 용출 과정에는 에테르나 염산구아니딘과 같은 강한 변성제가 필요하며, 단량체 수지는 10mM 바이오틴 완충액으로 부드럽게 씻을 수 있다.
(2) 포유동물 시스템에는 적어도 네 가지 바이오소화 단백질이 포함되어 있어 관심 있는 단백질로 씻는다. 그러나 대장균 시스템에서는 비특이적 결합이 거의 발생하지 않는다.
표위는 항원의 일부이며 항체 식별된다. 따라서 테이블 비트 태그는 일반적으로 항체 기반 분석 실험에 사용됩니다. 표위 라벨은 일반적으로 친화라벨보다 짧기 때문에 단백질의 기능에 거의 영향을 주지 않는다. 친화순화에도 사용할 수 있지만 면역 항체 기반 기둥은 가격이 비싸고 친화라벨만큼 효과적이지 않습니다. 에피토프 라벨은 테스트에 큰 장점이 있습니다. 세포 배양과 면역 침전에 널리 쓰인다.
인간 c-myc 는 증식세포에서 표현 수준이 낮으며 인간 종양 발생에 중요한 역할을 한다. C-myc 태그는 C-myc 유전자의 C 측에서 유래하여 항체 효과적으로 식별할 수 있다. 따라서 WB, 면역침전, 스트리밍 세포계 등과 같은 단백질 검사에 광범위하게 적용된다.
참고 사항:
(1) 분비 신호 융합: c-myc 꼬리표는 단백질의 N 쪽이나 C 쪽에 둘 수 있지만 분비 신호 경로를 융합하지 않는 것이 좋습니다. 분비 신호 경로의 위치에 영향을 줄 수 있습니다.
(2) 친화순화: 단백질 순화에도 사용할 수 있지만 거의 사용되지 않는다. 세탁은 매우 낮은 pH 값으로 진행되어야 하기 때문에 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있기 때문이다.
인플루엔자 바이러스 혈응고소 (HA) 라벨은 HA 글리코겐에서 유래한 것으로 인플루엔자 바이러스 표면에 존재하며 바이러스의 전염성 역할을 한다. HA 는 작은 펩타이드 라벨이기 때문에 단백질의 기능에 거의 영향을 미치지 않으며 ELISA, WB, 면역 침전 등과 같은 단백질 검사에 사용할 수 있습니다. 항-HA 항체 또한 단백질 정제에 사용될 수 있습니다.
참고 사항:
친화순화: HA 꼬리표는 시들어가는 세포의 단백질을 표시하는 것을 권장하지 않는다. HA 태그는 카스파 3 과 카스파 7 에 의해 잘려 면역반응성이 떨어진다.
DDDK 또는 FLAG 는 유일한 특허 태그 (sigma) 로 다른 테이블 태그보다 친수성이 뛰어납니다. 필요한 경우 DDDK 레이블에 포함된 장 키나아제 절단 시퀀스는 융합 단백질에서 레이블을 잘라낼 수 있습니다.
참고 사항:
친화순화: DDDK 항체 역시 단백질을 효과적으로 순화할 수 있지만, 보통 다른 색보주보다 비싸다.
V5 라벨은 부점바이러스 유인원 바이러스의 P 단백질과 V 단백질에서 유래한다. V5 라벨은 두 가지 크기, 9- 14 아미노산이 있습니다. 그러나 비교적 긴 상용화. 때때로 V5 태그는 His- 태그와 함께 사용됩니다.
주의해야 할 점은 다음과 같습니다.
교차 반응: 포유류 표현 시스템을 사용하면 교차 반응이 발생할 수 있습니다.
1992 부터 GFP 유전자가 복제되어 현재 많은 형광 라벨을 사용할 수 있다. 형광 마크의 가장 큰 장점 중 하나는 독이 없기 때문에 살아있는 세포에 사용할 수 있다는 것이다. 형광 라벨은 크지만 대부분의 단백질 기능에 큰 영향을 미치지 않습니다.
GFP 는 크기가 26.9KD 인 형광 표시이지만 다른 많은 표시도 사용할 수 있습니다.
다양한 형광 마크를 사용하려는 경우 다른 자극과 방출 피크를 선택하는 것이 중요합니다. 발사봉이 겹치면 두 형광을 구별하기 어렵다.
일반적으로 사용 가능한 스펙트럼에서 가장 밝은 형광 마커를 사용하여 단백질을 표시하려고 합니다. 이렇게 하면 명확한 신호를 얻고 잠재적인 배경 형광을 극복할 수 있습니다. 밝기 값은 단백질의 소광 계수와 양자 수율의 곱이다. 그러나 얻은 숫자는 설명하기 어려울 수 있습니다. 따라서 일반적인 측정 방법은 형광 레이블의 밝기를 EGFP 와 같은 표준 레이블과 비교하는 것입니다.
성숙은 형광 표시가 제대로 접혀 발색단을 형성하고 형광을 방출하기 시작하는 시기를 정의합니다. 살아있는 세포의 시간에 민감한 사건에서 짧은 성숙 시간이 매우 중요하다. 예를 들어 SfGFP, 10 분이면 접을 수 있지만 mOrange 는 보통 4 시간이 걸립니다.
표백은 광 안정성의 척도이다. 발색단이 자극된 후 얼마나 오래 발광능력을 잃는가 하는 것이다. 장시간 지연 실험을 할 예정이라면 광 안정성이 높은 라벨을 고려해 보세요. T- 사파이어의 표백 반감기는 25 초이고 EGFP 는 훨씬 안정적입니다. 보통 174 초입니다.
대부분의 단백질과 마찬가지로 형광 마커는 ph 값, 온도 및 산소 수준의 영향을 받습니다. 사용하는 조건에 따라 올바른 태그를 선택해야 할 수도 있습니다.
PH 값은 발생 및 방출 피크에 영향을 주며 대부분의 형광 마커는 산에 민감합니다. 일부는 pH 값이 변경될 때 형광 강도 (예: pHTomato) 를 변경할 수도 있습니다. PKa 값은 pH 감도의 좋은 지표입니다.
또한 온도와 산소 수준은 성숙 시간에 영향을 미칩니다. 저산소증은 보통 성숙 시간을 지연시킨다. 그러나 새로운 형광 표시 UnaG 는 저산소수준 상태에서도 형광을 방출할 수 있다.
대부분의 형광 마커는 포유류 세포나 조직이 아닌 해파리나 산호단백질에서 나왔기 때문에 사용할 수 있는 아미노산 코돈에는 종 차이가 있어 표현 수준이 낮고 신호가 약해질 수 있다.
다행히도, 많은 새로운 버전의 형광 라벨은 포유류의 높은 표현에 맞게 코돈 최적화되었습니다. 따라서 사용하기 전에 시퀀스가 대상 시스템에서 표현될 수 있는지 확인해야 합니다.
또 다른 중요한 점은 라벨이 단량체인지 이합체인지 확인하는 것입니다 (단량체는 일반적으로 mCherry 와 같은 "M" 으로 표시됨). 이것은 너의 실험에 영향을 줄 것이다. 많은 초기 형광 마커는 올리고머를 형성하기 쉽고 단백질 융합 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, EGFP 는 단체 라벨이지만 고농도에서는 이량 체를 형성하여 세포 소기관을 파괴하거나 FRET 과 같은 실험을 파괴할 수 있습니다.