파라포름알데히드 고정은 실로 오랜 이야기지만 많은 대학원생들이 실험을 하다 보면 파라포름알데히드로 고정해 달라고 부탁하는 형제자매도 있을 것이다. 염색을 하기 위해 염색 후 줄을 서지 못하고 오랫동안 안정적인 품질을 유지하려는 분들도 계십니다. 그래서 입소문으로 전해졌다.
접두사 문제
과학 연구 또는 임상 실습을 수행할 때 많은 FLOWER는 다음 세 가지 목적으로 습관적으로 표본에 4% 파라포름알데히드를 사전 고정할 수 있습니다. (1) 미생물 비활성화의 경우 안전성 확보를 위해 검체 내에 존재할 수 있는 세균, 바이러스 등의 오염물질을 제거합니다. (2) 검체를 장기간 보관할 수 있기를 바랍니다. (3) 세포내염색 전 준비물을 준비합니다. 그러나 많은 사람들이 한 가지 점을 간과했을 수 있습니다. 즉, 염색 전에 검체를 파라포름알데히드로 고정하면 고정 후 세포 표면의 일부 부위의 형태가 바뀌어 항체가 결합할 수 없게 되어 위음성이 발생할 수 있다는 것입니다. 또한 고정 효과로 인해 다른 부위가 손상될 수 있습니다. 반점은 비특이적 결합을 생성합니다(위양성).
따라서 염색하기 전에 어떤 항체가 접두사로 붙일 수 없는지 아는 것이 매우 중요합니다. 다행스럽게도 우리는 Biolegend 웹 사이트 [1]에서 사려 깊은 기술 직원이 우리를 위해 일련의 테스트를 수행했습니다. 하나는 인간 항원이고 다른 하나는 마우스입니다. 미리 고정할 수 없는 항체의 대부분은 케모카인 수용체인 것으로 밝혀졌기 때문에 실험 중에 먼저 고정한 후 염색하지 않도록 모두 주의해야 합니다.
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표 1. 다양한 항체의 표면 염색에 대한 4% 파라포름알데히드 접두사 효과(인간) 고정은 큰 영향을 미칩니다.
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p>표 2. 다양한 항체(마우스)의 표면 염색에 대한 4% 파라포름알데히드 접두사 효과 체크 표시는 접두사가 허용됨을 나타냅니다.
염색 후 고정 문제
염색 후 고정은 항원 형태와는 거의 관련이 없으며 플루오레세인과 더 관련이 있습니다. 과거에는 4색 미만일 때에는 사용되는 형광단이 non-tandem이어서 대부분 효과가 거의 없었으나, 다양한 새로운 tandem 염료의 등장으로 paraformaldehyde 고정이 문제가 되고 있다.
실제로 직렬 염색 마커(예: PE-cy7, APC-cy7 등)가 있는 항체를 검색하면 이를 나타내는 좀 더 자세한 설명을 찾을 수 있습니다(APC에 대해서는 BD 웹사이트 검색) - cy7 항체의 예):
고정된 세포는 파라포름알데히드에 고정한 후 4시간 이내에 분석하거나 밤새 보관하기 위해 파라포름알데히드가 없는 완충액으로 옮겨야 합니다.
이는 더 많은 양의 세포를 사용해야 함을 의미합니다. 파라포름알데히드로 고정된 시료는 4시간 이내에 테스트해야 합니다. 그렇지 않으면 탠덤 염료가 쉽게 분해될 수 있으므로 장기간 보관할 경우 여전히 세척하고 파라포름알데히드가 포함되지 않은 완충액으로 옮겨야 합니다.
GFP 형광 검출을 하는 학생들도 파라포름알데히드 고정이 GFP에 영향을 미친다는 사실에 주의해야 한다. 뉴욕 의과대학의 폴 루카스(Paul A Lucas)는 이것이 파라포름알데히드 때문이라고 믿는다. 고정은 GFP 형광을 소멸시키지 않지만 GFP 단백질의 형태를 변경하여 형광을 생성할 수 없게 만듭니다[2]. 때로는 고정 후 감지하는 형광이 자가형광일 수도 있고 형태가 변경되지 않은 나머지 GFP에서 방출될 수도 있습니다.
해결책
1. 위 표에서 파라포름알데히드에 쉽게 영향을 받는 분자를 테스트하는 경우 샘플을 보존해야 하는 경우에는 Prefix를 사용하지 마십시오. 오랜 시간이 지나면 유핵 세포를 동결하는 것을 고려할 수 있습니다.
2. 위 표에서 파라포름알데히드에 영향을 받지 않는 분자를 검출하는 경우에는 1% 파라포름알데히드로 접두고정하여 보존할 수 있으나 장기간 사용할 수 없습니다. 강도는 세포 FSC, SSC 및 형광에 영향을 미칩니다.
이때 FlowGuard™ Cell Preservation Solution[3]을 사용해 보시기 바랍니다. FlowGuard™는 파라포름알데히드를 함유하지 않고 FSC의 특수한 약하게 고정된 성분을 방출할 수 있는 국내 특허 제품입니다. 파라포름알데히드는 비교적 적고 항원 강도를 오랫동안 유지합니다. 샘플: 보존 용액 = 6:1 ~ 10:1 테스트 결과는 21일 이내에 안정적입니다.
3. 염색 후 약 24시간 동안 형광을 안정적으로 유지하고 싶다면 우선 빛을 피하고 4도의 색상(BV405, KO, FITC, PE, ECD)을 사용했습니다. , PE-cy5.5, PE-cy7, APC, APC-A700, APC-cy7), 유세포 분석 체계의 비공식 테스트 중에 여러 사례가 24시간 동안 4도 암소에 보관된 후 측정되었습니다. 형광강도에는 거의 변화가 없었고, 세포분류도 양호하였다. 그래도 걱정된다면 탠덤염료에 적합한 시판 특수보존제 구입을 고려해보세요