커넥터의 본질은 기본적으로 유동 세포의 과뉴클레오티드와 같거나 보완적인 조각 P5/P7 의 세 부분으로 구성된 짧은 염기서열이다. 시퀀싱 프라이머 결합 부분 R1/R2; 서로 다른 샘플을 구분하는 데 사용되는 인덱스/바코드입니다. 커넥터는 테스트할 DNA 세그먼트와 흐름 풀 사이의 다리로, 커넥터에 연결되면 대상 세그먼트가 흐름 풀에서 증폭되고 서열화될 수 있습니다.
커넥터의 분류 방법에는 크게 두 가지가 있습니다. 하나는 인덱스 기반 위치이고 다른 하나는 PCR free 일치 여부에 기반합니다.
(1) 커넥터는 색인 위치에 따라 1 단 색인 커넥터와 2 단 색인 커넥터로 나눌 수 있습니다. 단일 끝 색인 커넥터는 색인이 P5 또는 P7 (일반적으로 P7) 에만 존재한다는 것을 나타내고, 이중 끝 색인 커넥터는 색인이 P5 와 P7 모두에 존재한다는 것을 나타냅니다. (그림 2 참조). 인덱스 수는 최종적으로 혼합될 수 있는 샘플 수에 직접적인 영향을 줍니다. 양단 색인은 일단 색인보다 더 많은 샘플을 수용할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 한 번에 더 많은 샘플을 측정하는 수요를 충족시키기 위해 눈금이 있는 양단 커넥터가 광범위하게 적용되었다.
그림 2: 커넥터는 인덱스 위치에 따라 1 단 인덱스 커넥터와 2 단 인덱스 커넥터로 나뉘며, 두 커넥터가 연결된 후의 다이어그램입니다.
(2) 커넥터가 PCR free 데이터베이스와 일치하는지 여부에 따라 커넥터는 긴 커넥터와 짧은 커넥터로 나눌 수 있습니다 (그림 3 참조). 긴 커넥터 (전체 커넥터라고도 함) 는 P5/P7+ 색인 시퀀스 +Read 1/2 를 포함합니다. 전체 커넥터가 TA 복제를 통해 DNA 조각에 연결되면 PCR 증폭이 필요 없이 컴퓨터에서 직접 서열을 해독할 수 있습니다 (DNA 양이 충분하면 컴퓨터에서 직접 서열을 해독할 수 있고, DNA 양이 부족할 경우 PCR 증폭이 필요합니다). 짧은 커넥터가 TA 복제를 통해 DNA 조각에 연결된 후 짧은 커넥터와 보완되는 프라이머는 PCR 을 통해 증폭되어야 하며, 증강산물은 전체 커넥터가 포함된 DNA 조각입니다 (그림 4 참조). 즉, 짧은 커넥터는 PCR 을 통해 전체 커넥터로 증강되어야 컴퓨터에서 서열을 해독할 수 있습니다.
관절의 중요한 부분인 인더스 (Index) 의 오묘함은 무엇입니까? 간단히 말해서, Index 는 혼합 샘플에서 서로 다른 샘플의 "ID 카드" 로, 그 자체가 기본 시퀀스, 일반적으로 6nt 또는 8nt 입니다. 이 "ID" 인식을 통해 혼합 샘플에서 단일 샘플의 데이터를 식별할 수 있습니다. 그럼 문제가 생겼습니다. 네 개의 염기가 무작위로 이렇게 많은 배열조합을 가지고 있습니다. 이것들은 색인으로 사용할 수 있습니까? 지수 시리즈를 선택하는 기준은 무엇입니까?
지표의 선택은 기초 균형과 레이저 균형이라는 두 가지 원칙을 만족시켜야 한다.
A) 기수 균형: 지수 시퀀스의 복잡성과 균형을 나타냅니다. 복잡성이란 기본 유형의 다양성을 의미합니다. 균형은 기수 간 분배 비율의 균형입니다. 기본 잔액은 단일 지수 내의 기본 잔액이 아니라 여러 지수 간의 잔액이라는 점에 유의해야 합니다. 최적의 색인 시퀀스에는 그림 5 와 같이 A, T, C, G 의 네 가지 염기가 모두 포함되어야 하며, 염기간 비율은 25% 에 가깝습니다.
B) 레이저 균형 (반드시 고려해야 함): 인덱스 시퀀스 세트 내에서 각 기본 위치인 A+C =G+T 가 충족되어야 함을 의미합니다. Illumina 시퀀서에서 두 개의 염기 * * * A 와 C 는 파장이 660nm 인 적색 레이저에 의해 자극됩니다. G 와 T*** 는 파장이 532 nm 인 녹색 레이저에 의해 자극된다. 레이저 균형은 염기 불균형의 어쩔 수 없는 행동이며, 그림 6 과 같이 인덱스 시퀀싱에서 염기식별의 품질을 어느 정도 높이고 데이터 분리에 문제가 발생할 가능성을 줄일 수 있다는 점에 유의해야 한다. 샘플 수량이 홀수인 경우 필연적으로 베이스 균형과 레이저 균형을 충족시킬 수 없습니다. 이때 두 개의 열이 완전히 보완되는 인덱스와 다른 인덱스를 선택하여 정렬 품질을 극대화할 수 있습니다.
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