개발 역사, 영향, 시퀀싱 원리 및 기술에 따라 대량 병렬 서명 시퀀싱, MPSS, Polony 시퀀싱, 454 피로 인산 시퀀싱, Illumina (Solexa) 시퀀싱, ABI 고체 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, ddNTP 따라서 단일 프라이머 PCR 시퀀싱 반응을 통해 생성된 PCR 제품은 3' 끝에 네 가지 형광 염료가 있는 단일 체인 DNA 혼합물로 1 염기의 차이가 나므로 네 가지 형광 염료의 시퀀싱 PCR 제품은 하나의 모세관에서 전기 영동하여 레인을 피할 수 있다. 분자 크기가 다르기 때문에 모세관 전기 영동의 물방울도 다르다. 분자가 모세관 판독 창을 통과할 때 레이저 탐지기 창의 CCD (전하 커플러) 카메라 탐지기는 형광 분자를 하나씩 감지할 수 있습니다. 여기 형광은 래스터에 의해 분할되어 서로 다른 기본 정보를 나타내는 서로 다른 색상의 형광을 구분하고 CCD 카메라에서 이미지를 동기화합니다. 분석 소프트웨어는 서로 다른 형광을 DNA 서열로 자동 변환하여 DNA 시퀀싱의 목적을 달성할 수 있다. 분석 결과는 젤 전기 영동지도, 형광 흡수봉도, 염기서열 등 다양한 형식으로 출력할 수 있다.
자동 포팅, 자동 샘플링, 자동 데이터 수집 및 분석과 같은 컴퓨터 자동 제어로 DNA 조각의 염기서열, 크기 및 정량을 측정하는 고급 정밀 기기입니다. PE 는 DNA 시퀀싱 젤 (POP 6) 과 GeneScan 젤 (POP 4) 을 포함한 젤 중합체도 제공합니다. 이 젤 알갱이들은 구멍 지름의 크기가 균일하여 젤 준비 조건이 일치하지 않아 시퀀싱의 정확성에 미치는 영향을 피한다. 주로 모세관 전기 영동 장치, Macintosh 컴퓨터, 컬러 프린터 및 전기 영동 액세서리로 구성됩니다. 컴퓨터에는 데이터 수집, 분석 및 기기 작동을 위한 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 최신 CCD 카메라 탐지기를 사용하여 DNA 시퀀싱을 2.5h 로 줄이고 PCR 세그먼트 크기 분석 및 정량 분석을 10 ~ 40 분으로 줄입니다.
기기는 DNA 시퀀싱, PCR 세그먼트 크기 분석 및 정량 분석 기능을 갖추고 있어 DNA 시퀀싱, 잡합 분석, 단일 체인 구조 다형성 분석 (SSCP), 마이크로위성 시퀀스 분석, 긴 세그먼트 PCR, RT-PCR (정량 PCR) 등의 분석을 수행할 수 있습니다. 일반적인 DNA 시퀀싱 외에도 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 유전자 돌연변이 검출, HLA 배합형 및 법의학을 수행할 수 있습니다.
I. 준비 작업
1 의 주 시약. BigDye 시퀀싱 반응 테스트 키트 BigDye Mix, 4 색 형광 마크가 포함된 ddNTP 및 PE 특허의 일반 dNTP, AmpliTaq DNA 중합 효소 FS, 반응 완충액 등.
Pgem-3zf (+) 이중 가닥 DNA 비교 템플릿 0.2 g/L, 테스트 키트 지원 시약.
3.M 13(-2 1) 프라이머 TGTAAAACGACGGCCAGT, 3.2 μmol/L, 즉 3.2 pmol/μl 은 테스트 키트
4.DNA 시퀀싱 템플릿은 PCR 제품, 단일 체인 DNA 및 플라스미드 DNA 일 수 있습니다. 템플릿 농도를 조정하려면 PCR 반응 1 μl 이 적당하다. 본 실험에서 측정한 플라스미드 DNA 농도는 0.2 g/L, 즉 200 ng/μ L 입니다.
5. 프라이머는 테스트할 DNA 단편에 따라 순방향 또는 역방향 프라이머를 설계하고 3.2 μmol/L, 즉 3.2 pmol/μ L 을 준비해야 합니다. 재조합 플라스미드에 공통 프라이머 시퀀스가 포함되어 있는 경우 M13 (-2/
탈 이온수 또는 삼중 증류수 소독.
7.0.2 밀리리터 또는 0.5 밀리리터 PCR 시험관 뚜껑에서 분리됩니다.
8.3 mol/L 아세트산 나트륨 (pH5.2) 은 40.8g NaAc·3H2O 를 70 ml 증류수에 용해시켜 빙초산으로 pH 를 5.2 로 조절하고 100 ml 로 정하여 고압 멸균 후 분식한다고 합니다.
에탄올 9.70% 와 절대 에탄올.
10.NAAC/ 에탄올 혼합물은 실온에서 10 을 저장할 수 있습니다. NaAc/ 37.5ml 의 무수에탄올과 2.5ml 3 몰/리터 NaAc 를 섞는다.
1 1.POP 6 시퀀싱 젤.
12. 템플릿 억제 시약 (TSR).
13. 10× 전기 영동 버퍼.
14. 자동 DNA 시퀀서.
15.PCR 기기
16. 데스크탑 냉동 고속 원심 분리기.
17. 데스크탑 고속 원심분리기 또는 포켓 원심분리기.
둘째, PCR 시퀀싱 반응
1. 0.2 ml PCR 파이프를 가져와 표지물로 표시하고, 파이프를 입상 얼음에 삽입하고, 아래 표에 따라 시약 추가:
시약 추가 템플릿 파이프를 측정하는 표준 제어 파이프
BigDye 혼합물 1 마이크로 리터 1 마이크로 리터
플라스미드 DNA 1 μ L-
PGEM-3Zf (+) 이중 가닥 DNA- 1 μ l
순방향 프라이머 1 μ L-
M 13(-2 1) 프라이머-1μ l
무균 탈 이온수 2 마이크로 리터 2 마이크로 리터
총 반응 볼륨 5 μl, 경량 광유나 파라핀 오일 없음, PCR 튜브 덮개 고정, 손가락 탄성관으로 섞여서 약간 원심합니다.
2. PCR 튜브를 9600 또는 2400 PCR 기기에 올려 증폭시킵니다. 98 C 변성 2 min 후 PCR 주기 매개변수는 96 C10S, 50 C 5S, 60℃4 min, 25 사이클, 증강후 온도는 4 C 로 설정됩니다.
아세트산 나트륨/에탄올 법에 의한 PCR 제품의 정제
1. 원심 분리 혼합물 및 증폭 생성물을 1.5 ml EP 튜브에 전달.
2. 25 μl 아세테이트나트륨/에탄올 혼합 용액을 넣고 충분히 흔들어 얼음 10 min 에 DNA 를 침전시킵니다. 4 C 에서 12 000 회전/분 원심 30 분, 상청액을 조심해서 버리세요.
3. 50μl 70%(V/V) 에탄올을 첨가하고 침전물을 두 번 세탁한다. 4 C12000R/MIN 원심 5 분, 튜브 벽의 상청액과 액체 구슬, 진공 건조 침전10 ~15 분
넷째, 전기 영동 전 시퀀싱 PCR 생성물 처리
1. 원심관에 12 μl TSR 을 넣고 심하게 흔들어 DNA 침전을 충분히 녹이고 경미한 원심력을 녹인다.
2. 용액을 뚜껑에서 분리된 0.2 ml PCR 관으로 옮기고 약간 원심합니다.
3. PCR 계기에서 열변성 (95 C 2 분) 을 한 후 얼음에서 불을 피워 사용한다.
동사 (verb 의 약어) 는 1 컴퓨터에서 작동합니다. 기기의 작동 지침에 따라 모세관을 설치하고, 모세관의 위치를 수정하고, 접착제를 수동으로 채우고, 정렬 시퀀스 파일을 실행합니다. 2. 기기는 자동으로 접착제를 모세관에 주입하고 1.2 kV 에서 5 분 동안 전기 영동을 미리 하고, 프로그래밍 순서에 따라 자동으로 샘플링하며 1.2 kV 에서 20 분, 7.5 kV 에서 2 시간 ... 3 전기 영동을 미리 한다. 4. 샘플당 총 전기 영동 시간은 2.5 시간 .. 5. 전기 영동이 끝나면 기기는 자동으로 컬러 시퀀싱을 분석하거나 인쇄합니다.
6. 시퀀스 분석기는 자동으로 시퀀스 분석을 수행하고 사용자 요구 사항에 따라 비교할 수 있습니다. 시퀀싱 순서가 알려진 경우 시퀀스 비교를 통해 서로 다른 염기를 별표로 표시하여 생산성을 높일 수 있습니다.
7. 기기 청결과 시퀀싱은 기기 조작 절차에 따라 기기 청결과 유지 보수를 진행한다.
여덟. 계산
1. 시퀀싱 반응 정확도 계산 공식: 100%- 차이 염기수 (N 수 제외) /650× 100%.
2. 차등 염기는 확정된 DNA 서열이 알려진 표준 DNA 서열과 다른 염기를 가리키며, N 은 기기가 읽을 수 없는 염기이다. SILVER SEQUENCETM DNA 시퀀싱 시스템은 민감한 은염색 방법을 통해 젤의 스트립을 감지하는 비방사성 서열 분석 시스템입니다. 은염은 방사능이나 형광에 더 빠르고 저렴한 대안을 제공한다. 시퀀싱 결과는 당일 얻을 수 있습니다. 전기 수영이 완료된 후 90 분 만에 서열을 읽을 수 있는데, 이는 기존의 방사성 시퀀싱으로는 할 수 없는 것이다. 또한 SILVER SEQUENCETM 시스템은 손질되지 않은 5'OH 과뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 특별히 손질된 과뉴클레오티드 비용을 낮췄다. 이 시스템은 방사성 방법에서 동위원소를 조심스럽게 조작할 필요가 없고 값비싼 형광이나 화학발광 기술 시약 등도 필요하지 않다. 또한 대부분의 형광 방법처럼 기기 감지 시퀀스 밴드를 사용할 필요가 없습니다.
Taq DNA 중합 효소는 95 C 에서 열 안정성이 매우 강하다. 이 시스템에서 사용하는 염기서열급 Taq DNA 중합 효소는 Taq DNA 중합 효소의 개선된 제품으로, 이중 체인 DNA 템플릿에 대한 작용이 매우 좋고 정확도가 높으며 줄무늬가 균일하며 배경이 낮다.
SILVER SEQUENCETM 시스템에는 dgtp 대신 7- deazadgtp (7-deazadgtp 또는 dITP) 와 같은 수정 뉴클레오티드 혼합물이 포함되어 있어 GC 가 풍부한 영역에서 발생하는 스트립 압축을 제거할 수 있습니다.
어닐링 온도는 열 사이클 정렬에서 가장 중요한 요소입니다. 높은 어닐링 온도는 템플릿의 2 차 구조를 감소시킬 수 있습니다. 프라이머-템플릿 페어링의 엄격함을 향상시킵니다. 체인 어닐링과 템플릿 2 차 구조는 작은 조각 PCR 산물 (:24mer GC 함량이 50% 정도인 프라이머가 최상의 결과를 얻을 수 있도록 제한한다.
이 시스템은 일반적인 시퀀싱 방법에 비해 다음과 같은 장점이 있습니다: (1). 이 방법에서 템플릿 DNA 의 선형 증폭에 따라 은 염색 기술이 시퀀스 밴드를 감지할 수 있도록 충분한 생성물을 생성하는데, 시퀀싱 반응에는 템플릿 유형에 따라 0.03 ~ 2 pmol 의 템플릿 DNA 가 필요합니다. (2) 각 트랜스젠더 주기의 고온은 이중 체인 dsDNA (DSDNA) 템플릿의 알칼리 변성과 에탄올 침전을 대체할 수 있으며, 트랜스젠더 주기는 PCR 반응산물과 같은 선형 DSDNA 템플릿의 빠른 재어닐링으로 인한 문제를 제거하는 데도 도움이 됩니다. (3) 고온 중합 효소 반응은 DNA 템플릿의 2 차 구조를 약화시켜 중합 효소가 높은 2 차 구조 영역을 통과할 수 있게 한다.
우선, 시약 준비하세요
1 .. 은 시퀀싱 DNA 시퀀싱 테스트 키트.
2. 아크릴 아미드 및 메틸렌 비스 아크릴 아미드 원액 (38% 아크릴 아미드 W/V, 2% 메틸렌 비스 아크릴 아미드 w/v): 95 g 아크릴 아미드, 5 g 메틸렌 비스 아크릴 아미드 용해 140 ml 이중 증기수, 250 ml
3. 10% 과황산 암모늄, 0.5 g 과황산 암모늄을 4 ml 물에 용해시켜 5 ml 까지 성형해 신용으로 신용해야 한다.
4. 10×TBE 버퍼 (1 mol/L Tris, 0.83mol/L 붕산,10 mmol/l eded
5.TBE 전극 버퍼: 10×TBE 버퍼를 1×TBE 예비로 희석합니다.
6. 테메드
7. 용액 고정/중지: 2 리터 10% 빙초산 (V/V) 대기.
8. 염색액: 2 g 질산은과 3 ml 포름알데히드로 초순수 2 리터에 용해되어 준비한다.
9. 현상액: 60 g 탄산나트륨 (Na2CO3) 을 초순수 2 리터에 녹여 사용하기 전에 3ML 37% 포름알데히드 37% 와 40 ml 황산나트륨 용액 (10 mg/ml) 을 넣는다.
10.95% 의 에탄올.
1 1.0.5% 빙초산.
12. 시그마코트. #SL-2).
둘째, 시퀀싱 반응
1. 각 시퀀싱 반응에 대해 4 개의 0.5ml eppendorf 시험관 (G, A, T, C) 을 표시합니다. 각 시험관에 2 ml 의 적절한 d/ddNTP 혼합물 (d/ddNTP 혼합물) 을 추가합니다. 1 방울 (약 20 μl) 광유를 넣고 뚜껑을 덮고 얼음이나 4 C 아래에 예비품을 보관하세요.
2. 그룹당 4 개의 시퀀싱 반응에 대해 eppendorf 시험관에 다음 시약 혼합:
(1) 샘플 반응:
플라스미드 템플릿 DNA :2. 1 pmol
5 배 시퀀싱 완충액: 5 밀리리터
프라이머: 4.5 피모어
무균 ddH2O 의 최종 부피는 16 밀리리터입니다.
(2) 반응 제어
PGEM-3Zf(+) 대비 DNA (4 밀리그램): 4.0 밀리리터.
5 배 시퀀싱 완충액: 5 밀리리터
PUC/M 13 정방향 프라이머 (4.5 피모어): 3.6 밀리리터.
3. 프라이머/템플릿 혼합물에 1.0 ml 시퀀싱급 Taq DNA 중합 효소 (5 μ/ml) 를 추가합니다 (위 2 단계). 이동액관으로 몇 번 빨아서 골고루 섞다.
4. 3 단계의 효소/프라이머/템플릿 혼합물에서 4 ml 을 추출하여 각 d/ddNTP 혼합물의 시험관에 추가합니다.
5. 마이크로원심분리기에서 원심분리기를 하여 모든 용액이 eppendorf 관의 바닥에 있도록 합니다.
6. 반응관을 95 C 로 예열된 열순환기에 넣고 중간 순환 패턴에 따라 순환절차를 시작합니다. 각 프라이머/템플릿 조합에 대해 최적의 어닐링 온도를 선택해야 합니다. 다음 절차는 일반적으로 프라이머에서 350 개의 염기의 길이를 읽을 수 있다.
7. 열순환 절차가 완료되면 각 세뇨관에 3 μlDNA 시퀀싱을 넣어 용액을 종료하고 마이크로원심분리기를 회전시켜 반응을 종료한다.
주의하다
(1) 시퀀싱에 사용되는 템플릿 DNA 의 양은 일반적으로 다음 요구 사항에 따라 추가됩니다.
템플릿 유형/길이 템플릿 수
200 염기쌍 (PCR 산물): 16 낙크 (120 fmol)
3000~5 000 BP (초나선 플라스미드 DNA): 4 mg (2 pmol)
48,000 염기쌍 (λ, 점토 DNA): 1 밀리그램 (3 1 fmol)
초나선 플라스미드는 느슨한 선형 이중 가닥 DNA 보다 약한 신호를 생성하기 때문에 템플릿으로 사용되는 초나선 플라스미드의 양은 다른 템플릿보다 큽니다.
(2) 다음 통식은 4.5 pmol 에 해당하는 유인물의 나크 수를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
4.5 pmol= 1.5 ng×n 여기서 n 은 프라이머 염기수입니다.
다음 통식은 1p mol 에 해당하는 프라이머 마이크로그램 수를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
Dsdna:1pmol = (6.6 ×10mg) × n 여기서 n 은 템플릿의 기본 로그입니다.
Ssdna:1pmol = (3.3 ×10mg) × n 여기서 n 은 템플릿의 기본 수입니다.
(3) Taq DNA 중합 효소가 비특이적 어닐링 프라이머를 연장하는 것을 막기 위해서는 열순환기가 95 C 로 예열되어야 한다. 온도 변화는 가능한 한 빨리 해야 한다. 다음 주기 시간에는 온도 변화 시간이 포함되지 않습니다. 어떤 모드를 사용해야 할지 잘 모르겠다면 1 모드로 시작하는 것이 좋습니다.
모드 1: 프라이머용
95 C 2 분 후 95 C 30 초 (변성), 42 C 30 초 (어닐링), 70 C1분 (연장) 입니다.
모드 2: GC 함량 ≥24 개 염기 또는 50% 보다 약간 짧은 프라이머에 적용됩니다.
95 C 2 분 후: 95 C 30 초 (변성), 70 C 30 초 (어닐링/확장).
(4) 종료액을 첨가한 후 샘플은 4 C 에서 밤을 지낼 수 있다.
3. 시퀀싱 겔 보드의 제조
1. 유리판 처리
은염으로 염기서열을 해독한 유리판은 매우 깨끗해야 한다. 보통 미지근한 물과 세제로 씻은 다음 이온물로 씻어 남은 세제를 제거한 다음 에탄올로 세탁한다. 유리판에 남아 있는 세제마이크로막은 젤 염색 과정에서 높은 배경 (갈색) 을 일으킬 수 있다. 젤은 접착제 용액으로 처리한 후 짧은 유리판에서 화학적으로 교합할 수 있다. 이 단계는 은염색 작업에서 젤이 찢어지는 것을 방지하는 데 매우 중요하다.
(1) 짧은 유리판 처리
① 5 밀리리터의 접착제 실리콘을 1 밀리리터 95% 에탄올과 0.5% 빙초산에 넣어 새로운 접착제 용액을 만든다.
② 새로 준비한 접착제가 담근 탈지면지로 꼼꼼히 깨끗하고 자연스럽게 건조한 유리판을 닦으면 반드시 판면 전체를 닦아야 한다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 예술명언)
③4 ~ 5 분 후 95% 에탄올로 유리판을 단방향으로 닦고 약간의 힘으로 수직으로 닦아낸다. 이 청소 과정을 세 번 반복하여 매번 깨끗한 종이로 불필요한 접착제 용액을 제거한다.
주의하다
① 에탄올의 95% 로 유리판을 단방향으로 닦을 때, 너무 세게 힘을 주면 더 많은 접착 실리콘을 가지고 가서 젤이 잘 접착되지 않게 한다.
② 긴 유리판을 준비하기 전에 장갑을 교체하여 실리콘이 접착되고 부착되는 것을 방지한다.
③ 고무액이 장유리판을 오염시키는 것을 방지하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 젤이 찢어질 것이다.
(2) 긴 유리판 처리:
① 시그마 코트 용액을 담근 면지로 깨끗한 장유리판을 닦는다.
②5 ~ 10 분 후 탈지면으로 유리판을 닦고 불필요한 시그마 코트 용액을 제거한다.
주의하다
① 사용한 젤을 물에 담가 면도날이나 플라스틱 스크레이퍼로 긁어낼 수 있다. 유리판은 반드시 세제로 철저히 청소해야 한다. 또는 10%NaOH 에 담근 후 젤을 제거합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 짧은 유리판을 청소하는 데 사용되는 도구는 긴 유리판을 청소하는 데 사용되는 도구와 분리되어야 합니다. 교차 오염이 발생하면 나중에 준비한 젤이 찢어지거나 느슨해질 수 있습니다.
젤의 제조
(1) 유리판은 접착실리콘과 시그마 코트로 처리한 후 고정할 수 있습니다. 이 방법에서는 유리판의 왼쪽과 오른쪽에 0.2mm 또는 0.4mm 두께의 사이드바를 배치하고 다른 유리판은 그 위에 눌렀습니다. 상어 치아의 평평한 가장자리를 긴 유리판의 한쪽에 삽입하고 클립으로 고정시킵니다.
(2) 필요한 젤 농도에 따라 아래 표에 따라 시퀀싱 젤을 준비한다. 보통 6 ~ 8% 의 젤 농도는 좋은 효과를 얻을 수 있다. 제비 과정에서 에테르를 적당량의 쌍증기수로 녹인 다음 ACR & amp；; Bis 와 10×TBE 완충액을 이용해 최종 부피를 99.2 ml 로 조절하고 0.45 mm 여과막으로 여과한 다음 황산암모늄과 TEMED 를 첨가했다. 에테르를 녹일 때 가열할 필요가 없다. 가열이 정말로 필요하다면 용액이 완전히 냉각된 후에야 TEMED 와 과황산 암모늄을 첨가할 수 있다. 일반적으로 접착제를 붓고 4 ~ 6 분 후에 중합을 시작합니다. 중합이 잘 되지 않으면 고농도의 TEMED 와 과황산 암모늄을 사용해야 한다.
(3) 접착제를 배합한 후, 접착제를 부을 수 있다. 일반적으로 젤을 층층 가장자리를 따라 유리판의 홈에 천천히 붓고, 붓고 그대로 두면 중합이 완성된다.
주의하다
(1) 고정장치를 사용하여 유리판을 고정할 때는 힘이 약간 큰 고정장치를 사용하여 충전 중 힘이 부족해서 접착제가 새지 않도록 하는 것이 좋습니다.
(2) 포팅 과정에서 기포 발생을 엄격히 방지해야 한다. 그렇지 않으면 시퀀싱 결과에 영향을 미칠 수 있다.
넷째, 전기 영동
1. 사전 전기 영동
(1) 젤 중합이 완료되면 상어 이빨 빗을 뽑고 빗을 거꾸로 뒤집고 이를 젤에 삽입하여 덧셈 구멍을 만듭니다.
(2) 젤 플레이트를 시퀀싱 젤 홈에 즉시 고정하십시오. 일반적으로, 시퀀싱 젤 슬롯의 상부 및 하부 홈은 분리되어 있으므로 젤 플레이트가 고정 될 때까지 완충액을 첨가 할 수 없습니다.
(3) 10×TBE 의 완충액을 1×TBE 로 희석하고, 완충액을 상하 전기 수영 슬롯에 넣고, 생성된 거품을 제거하고, 전원을 켜고, 사전 전기 영동을 준비한다.
(4) LKB 의 Macrophor 와 같은 일부 전기 영동 탱크는 수욕으로 가열되므로, 사전 전기 영동 전 수욕은 55 C 로 가열해야 한다. 어떤 사람들은 수욕으로 가열하는 것이 아니라, 상해의 정교한 유기유리 기구가 생산하는 시퀀싱 전기 수영 탱크와 같이 전기 영동에 의존할 때 스스로 발생하는 열량에 의존한다. 이 홈은 전체 젤판 온도를 일관되게 하기 위해 열 알루미늄 판 두 개를 끼워야 한다.
(5) 30 V/cm 의 전압에서 20-30 분 동안 전기 영동을 미리 한다. 사전 전기 영동의 과정은 젤에서 불순물 이온을 제거하는 동시에 젤판이 원하는 온도에 도달하도록 하는 것이다. 고온 전기 영동은 GC 가 풍부한 지역이 머리핀 구조를 형성하는 것을 방지하여 시퀀싱 결과에 영향을 줄 수 있다.
주의하다
(1) 상어 빗 (KLOC-0/) 으로 덧구멍을 만들 때, 톱니 끝이 접착제에 0.5mm 정도 삽입되도록 주의하고, 반드시 덧구멍이 새지 않도록 주의해야 한다. 그렇지 않으면 정확한 결과를 얻을 수 없다.
② 항상 위 전기 수영 탱크 안의 완충액이 새는지 주의해라. 그렇지 않으면 단락이 생기기 쉬우며 전기 수영 기구를 손상시킬 수 있다.
2. 샘플의 준비
사전 전기 영동할 때 샘플을 준비할 수 있으며, 반응한 샘플은 끓는 물욕에서 1 ~ 3 분 동안 가열하여 즉시 얼음 위에 놓을 수 있다. 샘플이 장기간 사용되지 않으면 다시 처리해야 한다. 두께가 0.4 mm 인 4 ~ 6% 폴리아크릴 아미드 젤을 사용할 수 있습니다. 두께가 0.4mm 미만인 접착제는 신호가 너무 약해질 수 있습니다. 견본을 추가할 때 상층으로 덮인 광유를 빨아들일 필요가 없고, 광유 아래의 파란색 샘플을 조심스럽게 빨아들인다.
샘플 로딩 및 전기 영동
전기 영동기를 끄고, 이동액관으로 완충액을 흡수하여 샘플 구멍을 씻고, 사전 전기 영동에서 확산된 에테르를 제거한 다음, 즉시 모세관 주입기로 샘플을 빨아들여 샘플 구멍에 넣는다. 샘플 추가 순서는 일반적으로 G, A, T, C 이며, 샘플 후 바로 전기 영동한다. 처음에는 30 V/cm 으로 전기 영동을 할 수 있고, 5 분 후에는 40 ~ 60 v/cm 으로 증가시켜 일정한 압력을 유지할 수 있습니다. 일반적으로 길이가 55 cm 이고 두께가 0.2 mm 인 젤판은 2500 V 의 일정한 전압에서 전기 영동으로 2 시간 만에 바닥에 도달할 수 있으며, 전기 영동 과정에서 전류는 28 mA 에서 25 mA 로 안정될 수 있다. 더 긴 시퀀스를 읽기 위해 2 라운드 또는 다중 라운드 로드를 사용할 수 있습니다.
주의하다
① 전기영동을 할 때는 반드시 젤판의 온도가 55 C 정도에 달하는지 주의해야 한다. 아직 그렇지 않다면, 너는 온도가 도달할 때까지 기다려야 한다.
② 일반적으로 전기 영동에서는 너무 높은 전압을 사용해서는 안 된다. 너무 높은 전압은 젤의 해상도를 떨어뜨려 스트라이프를 확산시킬 수 있기 때문이다. 전기 영동은 일정한 전력 전기 영동을 사용할 수 있다.
시퀀싱 젤 v 은 염색
염색 공정은 젤을 플라스틱 접시에 담가야 한다. 따라서 유리판과 크기가 비슷한 두 개 이상의 판을 사용합니다. 그릇에 신선한 용액을 넣기 전에 고품질의 물로 그릇을 씻어라.
1. 전기 수영 후 플라스틱 조각으로 두 개의 판을 조심스럽게 분리하고 젤은 짧은 유리판에 단단히 붙여야 한다.
2. 젤 고정: 젤 (유리판 포함) 을 플라스틱 접시에 넣고 고정/종료액에 담가 20 분 동안 충분히 진동하거나 샘플의 염료가 완전히 사라질 때까지 진동합니다. 젤은 고정/종료 용액에 밤새 보관할 수 있습니다 (진동이 없음). 고정/중지 솔루션은 색상 반응을 종료하는 데 사용됩니다.
3. 세안: 초순수 세안제로 3 회, 매번 2 분. 물에서 꺼내서 다음 용액으로 옮길 때, 고무판 가장자리를 잡고 10 ~ 20 초 동안 그대로 두어 물이 흘러나오게 한다.
4. 젤염색: 젤을 염색액으로 옮겨서 30 분간 충분히 흔들어줍니다.
5. 젤 개발
현상액에 (1) 포름알데히드 (3 ml) 와 황산나트륨 용액 (400 μl) 을 넣어 현상액 준비를 완료합니다.
(2) 염색액에서 젤을 꺼내 초순수가 들어 있는 접시에 담가 5- 10 초 동안 세탁한다. 젤이 초순수에서 현상액으로 옮겨지는 총 시간은 5 ~ 10 초를 넘지 않아야 합니다. 너무 오래 담그면 신호가 약하거나 신호가 손실될 수 있다. 침지 시간이 너무 길면 5 단계를 반복하여 염색액으로 담가 둘 수 있다.
(3) 젤을 1L (총량의 절반) 예냉 발색제로 즉시 옮기고, 템플릿 밴드가 나타나기 시작하거나 첫 번째 밴드가 나타나기 시작할 때까지 충분히 진동하고, 젤을 나머지 1L 발색제로 옮겨서 2-3 분 동안 또는 모든 밴드가 나타날 때까지 계속 발색합니다
6. 정색접착제: 현상액에 같은 부피의 정색/정지액을 직접 넣는다. 현상 반응을 멈추고 젤을 수리하다.
7. 젤을 초순수에 두 번 담가 매번 2 분 동안 담근다. 장갑을 끼고 고무판 가장자리를 잡고 이 작업 중에 접착제에 지문을 찍지 않도록 주의하세요.
8. 실온에서 젤을 건조시키거나 흡입과 가열을 통해 젤을 건조시킵니다. 가시광선 상자나 밝은 흰색 및 노란색 배경 (예: 용지) 에서 젤을 관찰합니다. 영구 기록이 필요한 경우 EDF 필름으로 실험 결과를 저장할 수 있습니다.
주의하다
시퀀싱산물 은염은 서열 정보를 밝히는 새로운 방법이며, 이 시스템의 성패는 여러 가지 요인에 의해 영향을 받는다.
① 수질은 염색의 성공에 매우 중요하다. 초순수 (NANOpureR 또는 Milli-QR 물) 또는 쌍증기수는 좋은 결과를 얻을 수 있다. 물에 불순물이 있으면 저 분자량 밴드가 나타나지 않을 수 있습니다.
② 탄산나트륨도 중요하다. 피셔와 코닥 ACS 시약 등급 탄산나트륨 (피셔 카탈로그 #S263-500 또는 S262-3 또는 코닥 카탈로그 #109-1999 와 같은 신선한 미국화학학회급 탄산나트륨을 사용하는 것이 좋다
③ 색칠 후 워싱 절차가 중요하다. 젤 세척 시간이 너무 길면 은 입자가 DNA 에서 분리되어 시퀀스 신호가 거의 없거나 전혀 없습니다. 세탁 시간이 너무 길면 염색 절차를 반복할 수 있습니다.
④ 젤 두께가 0.4 mm 을 초과하거나 아크릴 아미드 농도가 4 ~ 6% 를 넘으면 고색과 염색 시간을 연장해야 한다. 젤이 0.4 mm 보다 얇으면 염색 반응 후 세탁은 5 초 이하로 단축해야 합니다.
⑤ 발색 반응을 제외한 모든 단계는 실온에서 진행된다. 현상액은 배경 소음을 줄이기 위해10 ~12 C 까지 예냉해야 합니다. 참고: 사용하기 전에 현상액에 포름알데히드와 황산나트륨을 넣는다. 새로 준비한 염색과 현상 용액을 사용하다. 어떤 용액도 재사용하지 마라.
여섯째, EDF 영화 개발
EDF 막을 사용하면 시퀀싱 밴드의 대비를 높일 수 있습니다. 젤 스트라이프가 얕으면 EDF 필름으로 데이터를 전송하는 것이 좋습니다. 은염제는 이미지를 EDF 필름으로 전송한 후 밴드의 가독성을 향상시킵니다.
1. 암실에서 염색한 젤 (접착제가 있는 면이 위로 향함) 을 형광등 상자 위에 올려놓는다. 적절한 확산기가 있다면 흰색 라이트 박스도 사용할 수 있다. 노출 시간을 보장하기 위해 작은 EDF 필름으로 다른 시간의 노출을 수행하고 다른 노출 강도를 확인합니다. 일반 노출은 20 ~ 40 초 동안 좋은 결과를 얻을 수 있다.
2. 붉은 빛 아래에서 EDF 막의 결각을 찾은 다음 젤에 필름을 놓아 왼쪽 위 모서리에 틈이 있도록 합니다. EDF 막은 단면이기 때문에 틈새가 왼쪽 위 모서리에 있는지 확인해야 합니다.
3. 깨끗하고 건조한 유리판을 EDF 막에 놓고 램프 상자를 약 20 초 동안 엽니다.
4. 현상기에서 방사된 필름을 현상하여 수동으로 EDF 필름을 현상합니다. 다음 절차를 사용할 수 있습니다.
(1) 코닥 GBX 현상기에서 현상 1 ~ 5 분
(2) 워싱 65438 0 분;
(3) Kodak GBX 고정 용액에서 3 분 동안 그림자를 설정하십시오.
(4) 워싱 1 분.
주의하다
① EDF 필름이 현상되기 전에 젤은 완전히 건조해야 한다. 지문을 남기지 않도록 장갑을 끼고 조작하다. 또한 자동 세탁기는 EDF 필름에 사용할 수 없습니다.
② 다른 광원의 최적 노출 시간은 다를 수 있습니다. 작은 EDF 필름 조각에 대해 서로 다른 시간의 노출을 수행하여 사용하는 광원에 가장 적합한 노출 시간을 선택합니다. 영화 수첩을 참고하세요.
③ 노출 시간이 짧으면 EDF 필름 이미지가 더 깊어지고 노출 시간이 길면 배경을 약화시키는 데 도움이 된다. 새총' 은 생물 게놈에서 표적 유전자를 추출하는 방법이다. 먼저 물리적 방법 (예: 전단력, 초음파 등) 을 통해 생물세포의 염색체 DNA 를 유전자 수준에서 여러 조각으로 자릅니다. ) 또는 효소 촉진 화학 방법 (예: 제한 내체효소) 을 결합한 다음 적절한 전달체와 결합하여 재조합 DNA 를 수용체 세균으로 옮겨 증폭시켜 무성 생식의 유전자 라이브러리를 얻는다. 그런 다음, 스크리닝 방법과 결합하여 많은 형질 전환 균주 중에서 특정 유전자를 포함하는 균주를 선택하여 재조합 DNA 를 분리하고 회수한다.
이 방법은 유전자 공학 기술을 통해 목적 유전자를 분리하는 것으로, 직접 유전자를 분리하는 어려움을 우회하여 게놈 DNA 문고에서 목적 유전자를 선별하는 것이 특징이다. 이것은' 엽총 사격' 의 원리로' 명중' 한 유전자라고 할 수 있다. 표적 유전자가 전체 게놈에서 너무 작아서 운에 크게 좌우되기 때문에 사람들은 이 방법을' 엽총' 또는' 엽총' 실험이라고 부른다.
1. 제한적 내체효소로 대상 세그먼트의 대삽입 DNA 를 썰어 진지당 젤 전기 영동으로 회수한다.
둘째, 물리적 방법 (예: 초음파 등) 으로 회수된 큰 DNA 조각을 잘라냅니다. ) 그런 다음 t 4 DNA 중합 효소를 사용하여 DNA 의 작은 조각 끝을 평평하게 합니다.
셋째, 아가로 오스 전기 영동을 실시하여 젤을 통해 1 kbp ~ 2 kbp 의 DNA 조각을 회수한다. 그런 다음 BcaBestDNAPolymerase 를 사용하여 DNA 의 3' 끝에 A 염기를 추가합니다.
넷째, A- 꼬리가 추가된 DNA 조각을 T- 벡터에 연결한 다음 변환 및 복제합니다.
5. 양성 복제의 DNA 시퀀싱 (1 kbp ~ 2 kbp 삽입 조각 포함).
여섯째, 데이터를 편집하고, 마지막으로 큰 DNA 서열에 연결합니다.