2 영어 참조 중합 효소 연쇄 반응 [WS/T455-2014 건강 모니터링 및 평가 용어]
Pcr [ws/t455-2014 상태 모니터링 및 평가 용어]
3 중합 효소 체인형 반응의 정의인 폴리효소 체인형 반응 (PCR) 은 프라이머로 체외에서 DNA 또는 RNA 조각을 선택적으로 증폭시키는 검출 방법 [1] 을 말한다. 이 방법은 수혈 분야의 혈액형 분류, 골수 이식 배형, 수혈 전파질환의 병원체 검사 등에 사용할 수 있다 [1].
중합효소 사슬 반응 (PCR) 은 체외효소가 특정 DNA 조각을 합성하는 분자생물학 실험 방법으로, 주로 고온변성, 저온어닐링, 적정 온도로 세 가지 반복되는 열순환으로 이루어져 있다. 즉, 먼저 템플릿 DNA 를 고온에서 단일 체인으로 변형시키고, DNA 중합 효소를 사용하여 적절한 온도에서 두 개의 프라이머와 두 개의 템플릿 DNA 체인의 상보성 서열을 퇴화시킨 다음, DNA 중합 효소의 촉매 하에 네 가지 디옥시리보 핵산 삼인산 (dNTPs) 을 기질로 연장시켜 퇴화한 후의 프라이머를 연장한다. 반복적으로, 알려진 두 시퀀스 사이의 DNA 조각은 기하 배수로 증폭된다. [2]
4 중합 효소 체인형 반응의 역사 검토 4. 1 체외 핵산 증폭의 가장 빠른 구상은 코란나와 그의 동료들이 197 1 에서 제기한 것이다 하지만 당시 과뉴클레오티드 프라이머의 시퀀싱과 합성은 어려웠고, 당시 (1970)Smith 등은 DNA 제한 내체효소를 발견해 체외 복제 유전자를 가능케 했기 때문에 코란나 등 초기의 생각은 잊혀졌다.
4.2 중합 효소 체인형 반응의 발명은 1985 년까지 획기적인 중합 효소 체인형 반응 (PCR) 이 미국 PECetus 의 인류유전학 연구소 Mullis 에 의해 발명되어 체외에서 핵산 조각을 무한히 증폭시키는 꿈을 실현시켰다. 그 원리는 체내의 DNA 복제와 비슷하지만 시험관 안의 체외 DNA 합성에 적합한 조건을 제공한다. 첫째, 대장균 DNA 중합 효소의 Klenow 단편은 인간 게놈의 특정 단편을 증폭시키는 데 사용된다. 효소는 열에 약하기 때문에 변성 DNA 를 가열할 때마다 Klenow 효소를 다시 첨가해야 한다. 여러 샘플을 조작할 때 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 힘들며 오류가 발생하기 쉽습니다. 내열성 DNA 중합 효소의 응용으로 PCR 반응이 자동화되기 쉬워졌고, 이어 PECetus 는 최초의 PCR 열순환기를 출시하여 이 기술의 자동화를 현실로 만들었다. Mullis 등은 이 기술로 1993 년 노벨상을 수상했다.
중합 효소 체인형 반응 관련 기술의 발전 PCR 및 관련 기술의 발전 속도는 놀랍다. 제 1 회 및 제 2 회 PCR 기술 워크숍은 각각 1988 년 및 1990 년 미국과 영국에서 열렸다. 첫 번째는 PCR 의 응용과 기술 자체의 최적화에 초점을 맞추고 있습니다. 두 번째 회의의 주요 의제는 인간 게놈 프로젝트와 PCR 의 최신 진전이다. 이것은 PCR 에 대한 생물 학자들의 관심을 완전히 반영합니다.
(표) 중합 효소 연쇄 반응 관련 기술
이름의 주요 목적은 제인과 프라이머를 증폭시켜 미지의 유전자 조각을 증폭시키는 것이다
중첩된 PCR 은 PCR 의 민감도와 특이성을 높이고 돌연변이를 분석합니다.
다중 PCR 은 여러 돌연변이 또는 병원체 동시 감지
PCR 을 반전시켜 알려진 시퀀스의 양쪽에 있는 알 수 없는 시퀀스를 증폭시켜 산물 돌연변이를 일으킵니다.
단일 특이성 프라이머로 PCR 을 통해 미지의 게놈 DNA 를 증폭시켰다.
알 수 없는 cDNA 는 알려진 서열을 통해 일 측성 프라이머 PCR 로 증폭된다
PCR 을 앵커하여 다른 끝의 시퀀스를 분석합니다
협동PCR 은 프라이머 이합체를 줄여 PCR 특이성을 높인다.
고정화 된 PCR 은 제품 분리에 도움이됩니다.
오염 된 불순물 또는 PCR 제품 잔류 물을 제거하기위한 PCR 과 결합 된 막
상자 PCR 을 표현하여 합성되거나 돌연변이된 단백질 DNA 조각을 생성합니다.
연결 매개 PCR DNA 메틸화 분석, 돌연변이, 복제.
RACEPCR 증폭 cDNA 끝
정량 PCR 정량 mRNA 또는 염색체 유전자.
원위치 PCR 은 유전자 발현의 세포 비율을 연구하는 데 사용됩니다.
PCR 추정을 통한 박테리아 또는 유전 효과 확인
범용 프라이머 PCR 증폭 관련 유전자 또는 검출 관련 병원체
메신저 증강표형과 소량의 세포 mRNA 의 동기화 분석.
6 다른 증폭 기술과 PCR 및 관련 기술이 발달하면서 새로운 증폭 기술이 탄생하고 있습니다. 이러한 기술들은 각각 장단점이 있으며, PCR 과 상호 보완적이며, 일부는 함께 응용할 수 있다. * * * 동형은 이미 체외 핵산 증폭 기술의 대가족이 되었다. 우리는 분자 생물학 기술이 발전함에 따라 이 가문에 새로운 회원이 나타날 것이라고 믿는다.
기타 체외 핵산 증폭 기술 (table) 기술은 TAS (전사 종속 증폭 시스템) 를 이용하여 HIV 연결 효소 체인형 반응 (LCR) 검사점 돌연변이와 자율 서열 복제 (3SR) 시스템을 이용하여 RNA 를 연구한다. 임상 응용, 법의학 등 체인 교체 증폭 (SDA) 검사, 유전자 감정 Q 복제 효소 시스템은 프로브 감지 감도를 높이고, 순환 프로브 반응은 프로브 감지 민감도 6. 1 을 증가시킨다. (a) 연결 효소 체인형 반응 (LCR) 은 새로운 DNA 체외 증폭과 검출 기술로, 주로 점 돌연변이 연구와 목적 유전자 증폭에 쓰인다. 바이크만 1997 에서 개발한 것으로 대상 유전자 서열 중 점 돌연변이를 감지하고 특허를 획득했습니다.
LCR 의 기본 원리는 DNA 연결 효소를 사용하는 것입니다. 쌍사슬 DNA 조각 특이성 연결, 트랜스젠더 어닐링을 통해 3 단계 반복 순환, 대량 증강목적 유전자 서열.
LCR 증폭 효율은 PCR 과 유사합니다. 내열 연결 효소로 LCR 을 만드는 데는 두 개의 온도 순환, 94 C MIN 변성, 65 C 리 폴딩 및 연결, 30 회 정도 순환이 필요합니다. 그 제품의 검사도 편리하고 민감하다. 현재 이 방법은 주로 점 돌연변이 연구와 검사, 미생물 병원체 검출, 방향 돌연변이 등에 사용되고 있다. 단일 염기 유전병의 다태성과 산물 진단, 미생물 종의 감정, 암유전자 점 돌연변이 연구 등도 이용할 수 있다.
6.2 핵산 서열 의존성 증폭 (A) 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자존서열 복제 (3SR) 또는 재성장 서열 복제 기술이라고도 합니다. 과틀리 등은 1990 에서 이 기술을 처음 보도했다.
NASBA 는 주로 RNA 증폭, 검출 및 시퀀싱에 사용됩니다.
기본 방법은 다음과 같습니다: 증폭 반응액에 프라이머와 표본을 추가하고, 65 C1MIN 은 RNA 분자의 2 차 구조를 파괴하고, 37 C 로 식히고, 역전사 효소, T7RNA 중합 효소 및 RNase H, 37 C 반응/KLOC-0 을 추가합니다
NASBA 는 조작이 간단하고, 특수 기구가 필요 없고, 온도 순환이 없다는 것이 특징이다. 전체 반응 과정은 세 가지 효소에 의해 제어되며, 순환 횟수가 적고, 충실도가 높으며, 증강효율은 PCR 보다 높고 특이성이 좋다.
6.3 전사 의존성 증폭 시스템 (A) 전사 기반 증폭 시스템 (TAS) 은 Kwen 등이 1989 에서 보도한 것으로 주로 RNA 증폭에 사용된다.
TAS 의 주요 특징은 RNA 복제본 수가 10 의 기하급수적으로 증가하고 TAS 는 6 개의 순환 과녁 시퀀스만 있으면 복제 수가 2× 106 에 이를 수 있기 때문에 증폭의 효율성이 높다는 것입니다. TAS 의 또 다른 특징은 그것의 고도의 특이성이다. TAS 는 6 개의 온도 순환만 견딜 수 있기 때문에 혼합률이 낮고 글루칸 구슬과의 교배도 높다.
이 방법은 특이성과 민감성이 높지만 순환과정이 복잡하기 때문에 역전사 효소와 T7RNA 중합효소를 반복해서 첨가해야 하므로 더 연구해야 한다.
6.4 Qβ 복제 효소 반응 (a) 카신은 1972 와 같다. Qβ 복제효소는 RNA 템플릿의 자체 복제 기능을 촉발시켜 실온에서 30min 이 천연 템플릿 MDV 1RNA 를 109 로 증폭시킬 수 있다고 처음 보도했다. 1986 에서 Chu 등은 바이오메트릭 마크가 있는 과녁 서열 특이성 프로브가 항바이오틴 단백질에 연결된 MDV 1RNA 와 교잡할 수 있다고 보도했다. 결합되지 않은 MDV 1 을 씻은 후 Q 베타 복제 효소를 추가하여 MDV 1 의 복사본을 증폭하고 복제한 다음 브롬화 B 염색을 통해 해당 복사본을 탐지하거나 같은 소스의 두 번째 프로브와 교잡합니다.
Q 복제 효소는 RNA 가 지도하는 RNA 중합 효소로, 3 가지 특징이 있다. 1 과핵산 유인물의 지도가 없어도 RNA 합성을 시작할 수 있다. ② RNA 유전자의 분자 내 염기 쌍으로 형성된 독특한 RNA 접기 구조를 특이하게 식별할 수 있다. ③ Q 복제 효소 천연 템플릿 MDV 1 RNA 의 접히지 않은 구조 영역에 짧은 핵산 서열을 삽입해 효소의 복제에 영향을 주지 않는다. 따라서 핵산 프로브를 이 영역에 삽입하면 그 서열이 Q 베타 복제 효소에 의해 증폭될 수 있습니다.
Lizardi 등, 1988, T7 RNA 중합 효소를 사용하여 표적 유전자 서열 *** MDV 1 플라스미드에서 MDV 1 RNA 프로브를 전사한다. 이 RNA 프로브는 과녁 시퀀스와 교잡한 다음 교잡되지 않은 프로브를 씻어내고 Q 베타복제효소를 넣어 프로브를 증폭시킬 수 있으며, 증강된 프로브는 템플릿으로 기하급수적으로 증폭할 수 있다. 위의 두 가지 방법으로 제품을 검사하다. 이제이 기술은 샌드위치 하이브리드 화, 분자 스위치 및 표적 의존성 복제로 발전했습니다.
PCR 기술의 응용 사례: 연구: 유전자 복제; DNA 시퀀싱; 돌연변이를 분석하다. 유전자 재조합 및 융합; 단백질 결합 DNA 서열의 확인 및 조절; 트랜스포존 삽입 사이트 매핑; 유전자 변형 검출; 합성 유전자의 구축 복제 또는 발현 벡터 구축 유전자 핵산 엔도 뉴 클레아 제 다형성의 검출
진단: 박테리아 (나선형, 마이코 플라스마, 클라미디아, 지균, 리케차, 디프테리아, 치병성 대장균, 시가 이질균, 수기단포균, 어려운 방추균 등. ); 바이러스 (HTLV, HIV, HBV, HPV, EV, CMV, EBV, HSV, 홍역 바이러스, 로터바이러스 및 작은 바이러스 B19); 기생충 (말라리아 등). ); 인류유전병 (레슈니한 증후군, 지중해빈혈, 혈우병, BMD, DMD, 낭포성 섬유화 등). ) 을 참조하십시오
면역학: HLA 부문; T 세포 수용체 또는 항체 다양성의 정성 분석; 자가 면역 질환 유전자지도 작성; 림프인자 정량화
인간 게놈 공학: 반복적인 서열을 전파함으로써 DNA 마커를 생성합니다. 유전지도 작성 (DNA, 다형성 또는 * * * 매핑 검출); 물리지도 제작 시퀀싱, 표현 스펙트럼
법의학: 범죄 현장 표본 분석; 헤라디크
종양: 췌장암, 결장암, 폐암, 갑상선암, 흑색종, 혈액계 악성 종양.
조직 및 그룹 생물학: 유전 클러스터링 연구; 동물 보호 연구 생태; 환경과학 실험유산.
고생물학: 고고학 및 박물관 표본 분석
동물학: 동물 전염병 진단 등.
식물학: 식물 병원체 등을 검출하다.
8 PCR 의 기본 원리와 개념 8. 1 기본 원리 DNA 세포 내 복제는 복잡한 과정입니다. 복제에 참여하는 기본 요인으로는 DNA 중합 효소, DNA 연결 효소, DNA 템플릿, 효소 합성을 시작하는 RNA 프라이머, 뉴클레오티드 원료, 무기이온, 적절한 pH, 초나선 및 쌍사슬 DNA 구조를 푸는 효소와 단백질 인자가 있다.
PCR 은 시험관에서 DNA 복제 반응입니다. 그 기본 원리는 체내와 비슷하다. 차이점은 내열성 Taq 효소가 DNA 중합 효소를 대체하고, 합성 DNA 프라이머가 RNA 프라이머를 대체하며, 가열 (변성), 냉각 (어닐링, 단열 (확장) 등의 온도를 변경하여 DNA 를 복제할 수 있고, 반복되는 변성, 어닐링, 확장 주기는 DNA 를 무한히 증폭시킬 수 있다는 것이다. PCR 의 구체적인 프로세스는 다음과 같습니다.
PCR 반응 시스템이 약 95 C 로 가열되면 이중 체인 DNA 템플릿이 두 개의 단일 체인으로 묶여 트랜스젠더입니다. 그런 다음 온도를 유인물의 Km 값 이하로 낮추고, 3' 끝과 5' 끝의 프라이머는 각각 두 개의 단일 체인 DNA 템플릿의 보완 영역과 결합됩니다. 이 과정을 어닐링이라고 합니다. 반응체계의 온도가 약 70 C 로 올라가면, 열적으로 안정된 Taq DNA 중합효소는 템플릿 DNA 뉴클레오티드 서열의 보완적인 방식에 따라 4 가지 디옥시뉴클레오티드를 유인물의 3' 끝에 더해 새로운 DNA 사슬을 형성한다. 각 사이클은 반응 시스템의 DNA 분자 수를 두 배로 증가시킵니다. 이론적으로 몇 주기 후에 2 n 배로 증가할 것이다. 30 회 순환 후 DNA 생산량은 약 10 9 사본인 2 30 복사본에 이른다. PCR 증폭 과정은 그림 8 1 에 나와 있습니다. 실제로 확대 효율은 2 배 미만이므로 (1+r) n 이어야 합니다. 여기서 r 은 확대 효율입니다.
8.2 PCR 반응체계에 참여하는 요인과 PCR 반응에 참여하는 요인은 주로 템플릿 핵산, 프라이머, TaqDNA 중합 효소, 완충액, Mg2+, 디옥시 뉴클레오티드 삼인산 (dNTP), 반응온도와 순환수, PCR 기기 등이다. 그 기능은 다음과 같습니다.
(1) 템플릿 핵산
PCR 에 사용되는 템플릿 핵산은 DNA 또는 RNA 일 수 있습니다. RNA 를 템플릿으로 사용하는 경우 먼저 역전사 생성 cDNA 를 수행한 다음 정상적인 PCR 순환을 수행합니다. 핵산 템플릿은 광범위하게 구할 수 있으며 배양된 세포, 세균, 바이러스, 조직, 병리 표본, 고고학 표본에서 추출할 수 있다.
PCR 반응에서 DNA 템플릿의 가입량은 일반적으로 100 100000 사본입니다. 현재, 단일 세포에서 상응하는 cDNA 문고를 준비할 수 있다. 적정 함량의 DNA 템플릿은 여러 차례 순환된 PCR 로 인한 염기 불균형을 줄일 수 있다.
일반적으로 템플릿 DNA 는 선형 DNA 분자를 사용합니다. 링 플라스미드의 경우 링 DNA 리 폴딩이 너무 빠르기 때문에 먼저 효소로 선형 분자로 자르는 것이 좋습니다.
(2) 프라이머
프라이머는 PCR 증폭 산물의 특이성과 길이를 결정합니다. 그래서 프라이머 디자인은 PCR 반응의 성패를 결정한다.
PCR 반응에는 두 가지 프라이머, 즉 5' 엔드 프라이머와 3' 엔드 프라이머가 있다. 5' 끝 프라이머는 템플릿 5' 끝 시퀀스와 같은 과뉴클레오티드, 3' 끝 프라이머는 템플릿 3' 끝과 보완되는 과뉴클레오티드를 말한다. 프라이머에 대한 기본 요구 사항은 ① 프라이머의 길이가 너무 짧으면 PCR 의 특이성에 영향을 미치며 4 164.29 x 10 9 가 포유류 게놈 3X/KLOC 보다 크기 때문에 1630bp 가 필요합니다. 프라이머가 너무 길면 확장 온도가 Taq DNA 중합 효소의 최적 온도 (74 도) 를 초과하고 제품의 특이성에 영향을 줍니다. ②G+C 함량은 일반적으로 40% ~ 60% 입니다. ③ 4 개의 염기는 무작위로 분포되어야 하며, 연속적으로 같은 퓨린이나 텅스텐은 3 개를 넘지 않아야 한다. 특히 유인물의 3' 끝에는 3 개의 연속 G 또는 C 가 있어서는 안 된다. 그렇지 않으면 유인물과 핵산의 G 또는 C 농축 지역이 잘못 보완되어 PCR 의 특이성에 영향을 미칠 수 있다. ④ 프라이머 자체는 상보성 서열을 가질 수 없으며, 자기 접힘을 일으킬 수 있으며, 적어도 프라이머 자체의 연속 상보성 염기는 3bp 보다 클 수 없다. ⑤ 두 개의 프라이머는 보완 할 수 없다. 특히 3' 끝. 한 쌍의 프라이머 사이에 4 개를 넘지 않는 연속 염기는 프라이머 이합체를 피하기 위해 보완해야 한다. ④ 프라이머와 비특이적 표적 영역의 동원성은 70% 를 초과하거나 8 개의 연속 상보성 염기를 가질 수 없다. 그렇지 않으면 비특이성 증폭이 발생할 수 있다. ① 프라이머의 3' 끝은 확장을 시작하는 지점이다. 그러므로 잘못된 배합이 있어서는 안 된다. ATCG 가 초래한 잘못된 배합의 규칙성으로 인해 프라이머 3' 끝 A 의 영향이 가장 크므로 프라이머 3' 끝의 첫 번째 염기는 최대한 피해야 한다. 유인물의 3' 끝은 코돈 3 의 간결성으로 인해 특이성을 증폭시키는 것을 피하기 위해 코드코돈의 세 번째 염기가 되어서는 안 된다. ⑧ 제한 부위, 바이오틴, 형광 물질 및 디곡신 마커 추가, 돌연변이 부위 도입, 프로모터 서열 도입, 단백질 결합 DNA 서열 도입 등 프라이머의 5' 끝을 손질할 수 있다. 유인물의 설계는 컴퓨터 소프트웨어가 지도하는 것이 가장 좋다.
반응체계에서는 일반적으로 프라이머 농도가 0. 10.5 μ mol 사이여야 한다. 농도가 너무 높으면 프라이머 이량 체 또는 비특이적 생성물이 생기기 쉽다.
유인물의 Tm 값은 어닐링 온도와 관련이 있으며 Tm4(G+C)+2(A+T) 로 계산됩니다. 베이스 페인트의 Tm 값은 5580 C 범위 내에 있는 것이 가장 좋고 72 C 에 가까운 것이 가장 좋다.
(3) 열 안정성 TaqDNA 중합 효소
Chien 은 1976 에서 내열 중합 효소를 분리하고, Erlich 는 1986 에서 PCR 에 적합한 Tq 내열 중합 효소를 분리하여 PCR 이 실용기술이 될 수 있는 기반을 마련하고 유전자 재구성을 통해 생산되었다. 최근 PCR 에 사용할 수 있는 중합효소는 수생열균에서 추출한 Taq 효소, 열성 열성 모종에서 얻은 Taq 효소, Litoralis 기열구균에서 분리된 VENT 효소, 산-열욕 황화분열 모종에서 분리된 Sac 효소 등 여러 가지가 있다. 이 중 Taq 효소가 가장 널리 사용되고 있다. Taq DNA 중합 효소의 분자량은 94kD, 75 C 의 비활은 150bs/ 효소 분자이다. 반응 온도가 너무 높거나 낮으면 신장에 영향을 줄 수 있으며, TaqDNA 싹은 높은 열 안정성을 가지고 있다. 실험에 따르면 92.5 C, 95 C, 97.5 C 에서는 반감기가 각각 40 분, 30 분, 5 분이었다.
순화 후 Taq 효소는 체외에서 3'5' 핵산 외체효소 활성성이 없어 판독 보정 기능이 없어 증폭시 잘못된 배합을 일으킬 수 있다. 잘못 배합된 염기의 수는 온도, Mg2+ 농도 및 주기 수의 영향을 받습니다. 보통 Taq 효소 30 회 순환 후의 오차율은 약 0.25% 로 Klenow 효소보다 높다. Taq 효소는 주기당 변이율이 1/30000 이고 염기교체율은 1/8000 입니다. 저농도 dNTP (각각 20 μ mol/L), 1.5mmol/L 의 Mg2+ 농도와 55 C 이상의 보복 온도를 적용하면 Taq 효소의 충실도를 높일 수 있으며, 이 경우 평균 오차율은 5X/KLOC-0 에 불과합니다.
Taq 효소는 말단 전이효소 TdT 와 비슷한 활성성을 가지고 있어 새로 생성된 쌍사슬 산물의 3' 끝에 염기, 특히 dATP 를 추가할 수 있다. 따라서 PCR 제품을 캐리어에 복제하는 두 가지 방법이 있습니다. 하나는 dT 캐리어를 구축하는 것입니다. 둘째, Klenow 효소 제거 3'- 끝 A, 즉 PCR 반응 후 99 C 가열 10min 비활성화 Taq 효소, Mg2+ 농도를 5 10mmol/L 로 조절
Taq 효소도 역전사 활성을 가지고 있다. Mg2+ 농도가 23mmol/L 이고 온도가 68 C 일 때 역전사 효소 활성이 나타난다. Mg2+ 가 존재하면 역전사 활동이 더 좋다. 이 활동은 RNAPCR, 특히 단편 세그먼트의 증폭에 직접 사용될 수 있다.
이전에는 Taq 효소로 PCR 증폭을 할 때 400bp 미만의 DNA 조각만 증폭할 수 있었다. Taq 효소의 구조와 기능의 개조와 PCR 방법론의 개선을 통해 20kb 이상의 DNA 조각을 증폭시킬 수 있다.
PCR 반응에서 Taq 효소의 첨가량도 중요하다. 너무 적으면 좋지 않고, 낭비가 너무 많아 비특이적 증폭으로 이어진다. 보통 100μl 반응액당 12.5U Taq 효소가 더 좋다. 최적의 효소 농도는 0.55U 범위 내에서 결정되며, 또 다른 문제는 Taq 효소가 열 안정성이 좋은 공구효소이지만 20 C 에서 보존해야 한다는 것이다.
(4) 완충액
버퍼액은 PCR 반응에 적합한 pH 와 일부 이온, 일반적으로1050Mmol/L ... Trishci (PH 8.38.8) 버퍼를 제공합니다. 50mmol/L KCl 을 함유한 버퍼액은 유인물의 퇴화에 유리하다. 송아지 혈청 알부민 (100μg/L) 이나 젤라틴 (0.0%) 또는 트웨인20 (0.05% 0.1%) 또는 디설파이드 (DDT) 를 넣는 사람도 있다.
(5)Mg2+Taq 효소의 활성성은 Mg2+ 가 필요하다. 여름철 Mg2+ 농도가 너무 낮을 때 Taq 효소 활성이 현저히 떨어진다. Mg2+ 농도가 너무 높아서 효소가 비특이적 증폭을 촉매하게 한다. Mg2+ 의 농도는 프라이머의 어닐링, 템플릿 및 PCR 제품의 체인 해제 온도 및 프라이머 이량 체의 생성에도 영향을 미칩니다. Taq 효소의 활성성은 Mg2+ 농도와 관련이 있지만, PCR 반응체계에서는 dNTP, 프라이머, DNA 템플릿의 모든 인산기단이 Mg2+ 와 결합되어 Mg2+ 농도를 떨어뜨릴 수 있다. 따라서 Mg2+ 의 총량은 dNTP 의 농도보다 0.20.25mmol/L 높아야 합니다. 반응 시스템에 EDTA 와 같은 킬레이트 제가 포함되어 있다면 Mg2+ 의 일부를 결합할 수도 있습니다.
Mg2+ 의 최적 농도를 얻기 위해 다음과 같은 최적화 방법을 사용할 수 있습니다. 먼저 PCR 버퍼액에 Mg2+ 를 넣지 않고 구성된 10 mmol/L 의 Mg2+ 저장액에서 각 반응관에 일정량의 Mg2+ 를 추가합니다. 처음에는 농도 그라데이션이 0.5mmol/L (0.5, 0.5
(6) dNTP
DNTP 는 PCR 반응의 합성 원료입니다. 각 dNTP 의 농도는 동일해야 하며, 일반적인 농도 범위는 20200 gmol/L 이며, 이 범위 내에서 PCR 산물의 양, 반응의 특이성, 충실성 사이의 균형이 가장 좋다. 예를 들어, 각 dNTP 가 20μmol/L 이면 이론적으로 2.6μg 의 400bp DNA 를 생성할 수 있습니다. 4 dNTP 의 농도를 Km 값 (10 15μmol/L) 보다 높게 유지하면 염기 혼합의 충실도를 유지할 수 있습니다. DNTP 농도가 50 몰/리터보다 크면 Taq 효소의 활성이 억제된다.
(7) 반응 온도 및 사이클 시간
1. 변성 온도 및 시간
변성 단계는 PCR 반응에서 매우 중요합니다. 템플릿 DNA 와 PCR 제품이 완전히 변성되지 않으면 PCR 반응이 성공하지 못합니다. DNA 분자 중 G+C 함량이 많을수록 필요한 변성 온도가 높아진다. 과도한 변성 온도와 시간은 Taq 효소의 활성화에 영향을 줄 수 있다. 일반적인 변성 온도와 시간은 각각 95 C 와 30s 이며, 때로는 97 C 와 15s 를 사용한다. DNA 체인이 트랜스젠더 온도에서 분리되는 데는 몇 초밖에 걸리지 않지만 반응관 내부가 원하는 온도에 도달하는 데는 시간이 걸리므로 시간을 적절히 연장해야 합니다. 템플릿 DNA 가 완전히 변성할 수 있도록 7 10min 을 만든 다음 이후 주기에서 변성의 단계 수를 95℃/min 으로 설정하는 것이 좋습니다.
확장 100300bp 의 단편 세그먼트는 빠른 2 단계 PCR 방법, 즉 트랜스젠더 (9497 C), 어닐링 및 확장 (5575 C) 을 사용할 수 있습니다.
반응용액이 트랜스젠더 온도에서 증발하는 것을 막기 위해 반응관에 65438 02 방울의 액체 파라핀을 첨가할 수 있다.
리 폴딩 온도 및 시간
리 폴딩 온도는 PCR 의 특이성을 결정하며, 적절한 리 폴딩 온도는 프라이머 Tm 값의 5 C 보다 낮아야 한다. 어닐링 온도가 너무 낮아 비특이적 증폭이 발생합니다. 어닐링 온도를 높이면 증폭의 특이성을 높일 수 있으므로 어닐링 온도를 엄격하게 제어해야 한다. 어닐링 반응 시간은 일반적으로 65438 0 분입니다.
PCR 의 첫 번째 주기가 시작되면 Tm 값보다 훨씬 낮은 온도에서 반응이 시작됩니다. Taq 효소는 저온에서도 여전히 활성이기 때문에 프라이머와 템플릿의 비특이적 인터페이스에 비특이적 산물 또는 프라이머 이합체가 나타날 수 있으며, 비특이적 산물은 전체 PCR 반응에서 반복적으로 증폭되어 PCR 에 심각한 실패를 초래할 수 있다. 가능한 한 이러한 비특이적 증폭을 없애기 위해 열 시작 방법을 사용할 수 있습니다. 열 시작 방법은 여러 가지가 있습니다. 한 가지 방법은 PCR 시스템에 항 Taq 효소 항체 를 추가하는 것입니다. 항체 및 Taq 효소의 조합은 Taq 효소의 활성화를 억제한다. 그래서 처음에는 온도가 낮고 프라이머가 템플릿과 잘못 어울릴 수 있지만 Taq 효소는 비활성 상태이기 때문에 비특이적 증폭을 일으키지 않습니다. 열 변성이 발생할 때, 고온에서 항체 비활성화, Taq 효소 방출, 후속 확장 단계에서 작용과 표상을 할 수 있다.
이질적인 DNA 중합. 또 다른 열시동 방법은 파라핀으로 Taq 효소를 PCR 반응체계에서 분리시켜 실온에서 비특이적 증폭이 없도록 하는 것이다. 온도가 열 변성 온도로 올라가면 파라핀이 녹고 Taq 효소와 PCR 음성체계가 혼합되어 다음 단계에서 작용한다. 열시동은 PCR 증폭의 특이성을 높일 수 있다.
3. 연장 온도 및 시간
일반 확장 온도는 약 72 ℃입니다. 이 시점에서 Taq 효소 활성은 초당 35 100 개의 뉴클레오티드, 1 분이면 2kb 조각이 충분합니다. DNA 조각이 길면 증강시간을 적당히 연장할 수 있다. 연장 시간을 연장하면 비특이적 증폭이 발생할 수 있다.
4. 주기 수
주기 수는 주로 초기 대상 분자의 농도에 따라 달라집니다. 예를 들어 초기 대상 분자가 3x10 5, 1.5x 10 4,1x/kloc-인 경우 너무 많은 순환은 비특이적 산물의 수와 염기의 잘못된 배합의 수를 증가시킬 수 있다. PCR 반응 후기에 증강산물의 증가는 기하급수적인 성장이 아니라 이른바 플랫폼 효과다. 플랫폼 효과는 dNTP 와 프라이머 농도가 감소하고, 효소와 템플릿의 비율이 상대적으로 낮아지고, 여러 차례 순환한 후 효소 활동이 감소하고, 산물 농도가 높아지면 변성이 불완전하여 프라이머 확장에 영향을 미칠 수 있습니다.
(8) PCR 기기
수입과 국산 PCR 기기가 많아요. 기기의 난방 및 냉각 방식은 가스 난방, 물 난방 및 전기 난방 블록 가열일 수 있습니다. 온도, 주기 수, 시간 등의 매개변수는 이제 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 필요에 따라 기기를 선택할 수 있다.
PCR 법은 감도가 높기 때문에 소량의 과녁 분자를 무제한으로 증폭시킬 수 있다. 이에 따라 앞으로 PCR 증폭산물로 환경을 오염시키고 위양성 PCR 을 발생시키는 것을 방지해야 한다. 따라서 PCR 기기와 PCR 산물 검출 과정은 가능한 표본 준비와 PCR 반응관 준비와 분리되어야 하며, 서로 다른 방에 있는 것이 좋다. 일반적으로 실험 공간은 샘플 처리 영역, 반응 혼합 준비 및 PCR 증폭 영역, 제품 분석 영역 등으로 나눌 수 있습니다.
9 중합 효소 체인형 반응 검사 중합 효소 체인형 반응은 체외에서 특정 유전자나 DNA 서열을 빠르게 증폭시키는 방법이므로 체외 유전자 증폭이라고도 합니다. PCR 기술은 DNA 의 자연 복제 과정과 유사하며, 그 특이성은 과녁 시퀀스의 양끝과 보완되는 과뉴클레오티드 프라이머에 의존한다.
9. 1 중합 효소 사슬 반응 정상 체내 세균의 종류와 비율은 정상이며 인체는 동적 균형과 건강 상태에 있다.
9.2 중합 효소 사슬 반응의 임상적 의미 중합 효소 사슬 반응은 알려진 모든 목적 유전자 또는 DNA 단편을 빠르고 특이하게 증폭시킬 수 있으며, pg 수준에서 DNA 혼합물의 목적 유전자 증폭을 쉽게 시작할 수 있다. 낙크, 마이크로크, 밀리그램의 특정 DNA 단편에 도달할 수 있습니다. 이에 따라 PCR 기술은 나오자마자 분자생물학의 각 분야에 빠르게 응용되고 있다.
이상 결과: 각종 질병으로 인한 이상 (예: 매독). ① 매독 1 기. 즉, 잠복기 2 ~ 4 주, 외생식기에 진한 빨간색 하드 블록, 얕은 표면 궤양, 연골 경도, 림프절이 붓는다. ② 2 기 매독. 매독 1 ~ 2 개월 후, 전신피부와 점막에 대칭적인 범발성 발진, 발진, 구진, 농포 등이 나타났다. 점막 플라크와 편평한 사마귀가 나타나 전염성 강하다. ③ 3 기 매독. 감염 후 2 ~ 3 년, 심지어 10 년 동안 피부가 젤라틴으로 부어올랐고 골격 관절 심장 혈관을 포함할 수 있다. 주로 동맥염, 대동맥판 폐쇄 부전, 대동맥류 등으로 나타난다. 침범한 신경은 척추 결핵, 전신마비 (마비성 치매) 등이다.