1 인플루엔자 바이러스 배양용 세포 1?1 세포주의 선택 인플루엔자 바이러스를 초기 배양할 때는 닭 배아를 사용하지만, 닭 배아에서 인플루엔자 바이러스를 분리하면 바이러스 돌연변이와 알레르기 반응이 쉽게 일어날 수 있으며, 원인 대량 생산시 외인성 바이러스 오염 문제가 있습니다. Vero 및 MDCK 세포를 사용하여 인플루엔자 바이러스를 배양하면 위의 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스의 면역원을 더욱 안정적으로 만들 수 있습니다. Qi Fengchun [1] 등은 동일한 실험 조건에서 MDCK 세포에서 배양된 바이러스의 HA 역가가 Vero 세포의 HA 역가보다 현저히 높다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 인플루엔자 바이러스 세포주를 배양할 때 MDCK 세포를 선택합니다. 계대 수는 35세대 미만이 바람직하며, 너무 오래된 세포는 바이러스가 로드되기 어렵게 만듭니다. 1?2 세포에는 바이러스가 가장 잘 들어있습니다. 매우 왕성하게 번식하는 세포 연령의 MDCK 세포는 세포 연령이 있는 MDCK 세포의 경우 하루 전에 세포 배양 플라스크에 세포와 함께 6웰 플레이트에 파종해야 합니다. 바이러스를 로드하는 데 이틀이 사용되면 바이러스 배양의 양성률은 거의 0인 반면, 세포 연령이 12~24시간인 MDCK 세포의 바이러스 로드 양성률은 거의 차이가 없습니다[2]. 1?3 바이러스를 담을 수 있는 최적의 세포밀도는 우선 MDCK 세포의 밀도가 너무 얇으면 안 되며, MDCK 세포의 밀도가 너무 얇으면 세포가 자라지 못하게 됩니다. 촘촘하게 포장하면 바이러스 감염률도 크게 감소합니다. 바이러스를 로딩한 후 수확한 바이러스의 HA 역가가 가장 높을 때 세포가 우물을 막 덮도록 하는 것이 가장 좋습니다. 작업자가 하루 전에 6웰 플레이트에 세포를 접종할 경우, 세포의 성장 속도를 고려하여 다음날 바이러스를 로딩할 때 세포 밀도가 적절한지 확인해야 합니다. 둘째, MDCK 세포를 6웰 플레이트에 접종할 때 밀도가 균일해야 하며, 웰 가장자리에 세포가 모이는 현상이 발생하기 쉽고, 중간의 밀도가 너무 얇아도 영향을 미칩니다. 바이러스 로드의 양성 비율. 이러한 상황을 방지하려면 직원이 숙련되어야 합니다. 이러한 상황이 발생하는 경우 배양 플레이트를 가볍게 흔들어(액체가 튀는 것을 방지) 효과적으로 세포 분포를 개선할 수 있습니다. 2. 인플루엔자 바이러스 배양용 시약 인플루엔자 바이러스 배양에 사용되는 다양한 시약도 바이러스 배양 양성률에 큰 영향을 미칩니다. 첫째, 유효기간이 지난 시약은 사용하지 마십시오. 둘째, GIBCO와 같은 유명 제조사의 시약을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 셋째, 사용하기 전에 일정 기간 동안 냉장고에서 시약을 꺼내어 두는 것이 가장 좋습니다. 사용하기 전에 시약의 온도가 실온과 평형을 이룰 때까지 기다리십시오. 세포가 교체되면 초저온 시약이 세포의 성장 상태에 영향을 미치며, 바이러스를 넣기 전에 세포를 세척하면 초저온 시약으로 인해 세포가 갑자기 줄어들고 바이러스 배양 양성률이 감소합니다. 3 샘플 3.1 샘플 보관 샘플의 보관 기간은 바이러스 로드 양성률에 직접적인 영향을 미칩니다. 검체가 신선할수록 바이러스 배양 양성률이 높아집니다. 샘플이 제때에 세포를 로딩할 수 없는 경우, 반복적인 동결 및 해동을 피하기 위해 샘플을 -70°C 냉장고에 보관해야 합니다. 검체는 -20°C에서 냉장고에 보관할 수 없습니다. 인플루엔자 바이러스는 -20°C에서 매우 불안정합니다. 당일 채취한 검체를 다음날까지 접종할 수 없는 경우 검체를 냉장고에 보관해야 합니다. -20°C에서. 3.2 검체의 무균 처리 검체의 검체 채취 조건은 무균이 될 수 없기 때문에 검체 용액에 항생제가 있더라도 모든 박테리아가 사멸된다고 보장할 수 없으므로 양성 검체를 멸균된 1.5ml 원심분리기에 여과하는 것이 가장 좋습니다. 튜브. 일부 작업자는 오염을 방지하기 위해 세포 배양 플레이트에 항생제를 첨가합니다. 이렇게 하면 문제는 줄어들지만 세포가 손상되고 바이러스 배양의 양성률이 감소합니다. 4 바이러스 로딩 단계 4-1 세포 세척 6웰 플레이트에 세포 배양 배지를 붓고 각 웰을 HBSS로 3회 이상 세척합니다. 이 기능은 트립신 복제를 억제하여 잔류 FBS를 씻어내는 것입니다. 바이러스의. 세척액을 버린 후 즉시 세척액이나 바이러스 용액을 첨가하십시오.세포를 공기에 너무 오랫동안 노출시키면 바이러스 배양의 양성률이 크게 감소하므로 세포가 공기에 노출되는 시간을 줄이는 것이 가장 좋습니다. 5초 이내. 4?2 바이러스액의 접종량 바이러스액의 접종량은 매우 특이하다. 세포에 로드된 바이러스 액체는 300u보다 커야 합니다. 그렇지 않으면 세포의 전체 웰을 덮기에 충분하지 않습니다.

37!로 1~2시간 배양한 후, 처음에 아무리 많은 양의 바이러스 액체를 주입하더라도 바이러스 배양액을 모두 버리거나 너무 적은 경우 바이러스 배양액을 추가하기 전에 각 웰에 300ul의 바이러스 액체를 남겨 두어야 합니다. 왼쪽에서는 바이러스 배양액이 너무 많이 유지되면(예: 400u 이상) 양성률도 크게 감소합니다. 정상적인 바이러스의 복제. 4.3 바이러스 액체의 배양 시간 이론적으로 바이러스 액체는 37°C에서 1~2시간 동안 배양할 수 있지만, 1시간은 여전히 ​​너무 짧은 것으로 나타났습니다. 바이러스 배양 배지를 1시간 15분에 첨가하는 것이 가장 좋습니다. 너무 오래 걸리지 마십시오. 그러면 바이러스가 배양될 수도 있습니다. 배양 양성률의 감소는 샘플링 용액의 pH 값이 바이러스 배양 배지의 pH 값과 다르고 배양 시간이 약간 길어지기 때문일 수 있습니다. 시간이 지나면 세포가 손상될 수 있습니다. Blind transfer의 경우 이때 사용하는 바이러스액도 검체채취액이 아닌 바이러스 배양배지이기 때문에 배양시간은 2시간 이상이 될 수 있습니다. 4-4 바이러스 배양 배지 준비 바이러스 배양 배지는 DMEM, HEPES 및 트립신을 첨가하여 준비됩니다. HEPES의 기능은 시스템의 비절단성 HA0를 변환하는 것입니다. 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌(H)이 절단되는 경우에만 감염성이 있기 때문에 바이러스 입자를 HA1 및 HA2 유형으로 절단하여 인플루엔자 바이러스의 세포 내 복제 능력을 향상시킵니다. 그러나 HEPES와 트립신을 4!***에서 너무 오랫동안 DMEM에 보관하면 pH 값이 상승하므로 일반적으로 즉시 사용할 수 있도록 바이러스 배양 배지를 준비합니다. 4.5 바이러스 HA 역가 결정 CPE의 출현 시간은 바이러스의 유형과 계통, 감염 크기에 따라 다릅니다. 접종 3일 후 검체에서 CPE가 발생하는지 관찰합니다. CPE가 발생하면 HA 역가가 측정됩니다. 역가가 8보다 크면 바이러스 하위 유형이 HI 실험에 의해 결정됩니다. 바이러스 역가가 8 미만인 경우, 3일째에 HA를 측정합니다. 바이러스 로딩 후 7일 후에도 CPE가 나타나지 않고 유지 용액에서 HA 활성이 검출되지 않으면 해당 샘플은 음성으로 간주되어 폐기될 수 있습니다. 바이러스 역가의 최고 피크는 3d에서 나타났으며, 4d와 2d 모두 3d의 바이러스 역가보다 낮았습니다. 바이러스 균주를 수확하기 전에 -80°C/37°C에서 세포를 한 번 동결 및 해동하여 바이러스의 HA 역가를 높이는 데 도움을 줍니다.