원칙: 포름알데히드로 처리된 세포는 목적단백질과 DNA 를 교차시키고, 교차된 염색질은 초음파에 의해 작은 조각으로 끊어지는데, 보통 200-600bp 범위 내에 있다. 그런 다음 항원과 항체 이성 인식 반응을 이용하여 목적단백질과 결합된 DNA 조각을 침전시켰다. 마지막으로 순화된 DNA 를 교차시켜 PCR 과 고통 측정순서를 통해 증폭한 후, 마지막으로 기존 게놈 서열과 비교해서 DNA 결합단백질의 서열을 확정한다. (존 F. 케네디, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 순화명언)
문제 분석:
1. 포름 알데히드 가교 결합은 후속 분석에 어떤 영향을 미칩니 까?
올랜도 5 세 등 최초의 칩 기술 발명부터 10 여 년이 지났지만 핵심 단계는 크게 변하지 않았다. 하지만 ChIP-seq 기술에도 포름알데히드와 같은 결함이 있습니다. 포름 알데히드는 고 투과성 가교제이지만 반응성이 아민으로 제한되기 때문에 가교 결합 효율이 낮습니다. 포유류 세포의 경우 최대 가교 효율은 1% 에 불과하다. 따라서 포름 알데히드 가교 세포의 초기 양은 매우 커서 마이크로 세포와 단일 세포 샘플에 적용하기가 어렵습니다. 옥스퍼드 대학 출판사가 출간한' 체내 포름알데히드 교차: 블랙박스 분석' 에 따르면 차단단백질, NF-κB 등과 같은 일부 단백질은 포름알데히드를 통해 DNA 와 교착할 수 없다는 연구결과가 나왔다. DNA 에 머무는 시간이 5 초 미만인 단백질은 포름알데히드와 교착할 수 없다. 둘째, 포름알데히드는 다른 많은 관련이 없는 단백질을 DNA 에 교차시켜 후속 분석 데이터에 영향을 줄 수 있다. 포름 알데히드 가교 결합은 DNA 손상 반응 메커니즘을 유발하여 염색체 구성을 변화시켜 칩 결과를 왜곡시킨다는 보도가 나왔다. 또한 가열과 낮은 PH 하에서 가교 반응이 역전되기 때문에 DNA 알과 백질 가교 복합체의 안정성도 주목할 만한 문제다. 따라서 포름알데히드가 세포에 단백질의 분포를 어느 정도 반영할 수 있는지는 아직 확실하지 않다.
칩 기술은 포름 알데히드 가교 단계의 유무에 따라 두 가지로 나뉜다. 하나는 포름알데히드가 교차하는 X-ChIP (교차 및 기계적 절단 슬라이스) 입니다. 다른 하나는 인터체인지 없는 칩, 즉 N 칩 (Native-Chip) 입니다. X-ChIP 에 비해 N-ChIP 기술은 해상도가 높고 (MNase 를 사용하면 염색체를 핵소체 크기로 조각화할 수 있음), 포름알데히드 가교 결합으로 인한 비특이성 단백질이 DNA 에 축적되는 것을 방지하고, 포름알데히드 교차 항원 에피토프의 커버리지를 방지하고, 단계 수를 줄이고, 샘플의 손실을 줄이는 등 여러 가지 장점을 가지고 있다. 그러나 MNase 를 사용했기 때문에 N-ChIP 은 그룹 단백질 수정 연구에만 적합하기 때문에 대부분의 경우 전사 인자 연구에 사용할 수 없습니다.
초음파 인터럽트 방법과 효소 분해 방법의 비교?
효소:? MNase, 즉 마이크로구균 핵산효소와 같이 가장 많이 사용되는 효소는 핵소체 연결구 DNA 서열을 분해할 수 있는 핵산효소로, 처음에는 황금색 포도상구균에서 분리되었다. 염색질의 MNase 소화는 독립된 핵소체를 방출할 수 있다.
MNase 효소 가수 분해에는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, MNase 는 A/T 염기 부위를 절단하는 경향이 있어 A/T 농축 지역에서 핵소체의 표현이 실제보다 낮다. 둘째, MNase 는 핵소체 경계에서 정확하게 절단할 수 없어 염색질 개방 위치가 실제 상황과 다르다는 것을 확인한다. 게다가, MNase 는 취약한 핵소체를 소화하는 경향이 있다. 각기 다른 종의 실험 증거에 따르면 바삭한 핵소체는 유전자의 시동자와 전사 종료점을 차지하고 있으며, 바삭한 핵소체는 MNase 농도가 낮고 소화 시간이 짧은 경우에만 감지될 수 있기 때문에 바삭한 핵소체를 안정된 핵소체의 상대적 풍도로 정량하기가 어렵다는 것을 알 수 있다.
초음파 중단은 효소만큼 온화하지 않으며, 중단의 불균일성으로 인해 시퀀싱 결과 배경 소음이 높아 후속 데이터 분석에 영향을 미친다. 문장 편폭의 제한으로 인해 여기서는 군말을 하지 않는다.
그래서 효소 분해인지 초음파 중단인지 여부는 상황에 따라 달라진다. 다음과 같은 제안을 참조할 수 있습니다.
연구 중인 단백질이 고도로 표현되어 있고 그룹 단백질과 같은 DNA 와 밀접하게 결합되어 있다면, 샘플은 가교 결합 될 필요가 없으며 효소로 가수 분해 될 수 있습니다.
연구 중인 단백질의 표현 풍도가 낮거나 DNA 와 긴밀하게 결합되지 않는 경우, 예를 들어 전사 인자와 같이 단백질과 DNA 의 형태를 안정시키기 위해 교제제로 샘플을 고정해야 하는 경우가 많다. 이때 초음파로 깨는 것이 가장 좋다.
확장:
마이크로 세포 수준에 적합한 칩 기술 및 그 원리
1) 절단 마크 기술:
CUT-Tag 는 전사 인자의 결합점과 DNA 의 개방성을 연구하는 데 사용할 수 있다. 하루 만에 세포에서 데이터베이스까지 모든 단계를 완료할 수 있으며 고해상도 저소음 기능을 갖추고 있습니다. 시작 셀 수는 50 개로 줄일 수 있습니다. [1]
원리: 항원 항체 특이성 반응을 이용하여, 특이항체 및 염색체의 목적단백질 결합을 첨가하고, 이항과 이 항체 결합으로 더 많은 pA-Tn5 회전효소 복합체를 대상 단백질과 DNA 서열의 결합점으로 모집하고, 회전효소 복합체는 염색질 개방점을 절단하고, 절단된 DNA 조각의 양끝에 커넥터를 추가하며, 문고 구축이 완료되어 직접 서열을 해독할 수 있다. 기존의 게놈 서열과 비교해 보면 목적단백질과 DNA 의 결합점을 알 수 있다.
2) 냉각 순서:
Chil (염색질 통합 표시) 은 염색질 통합 표시 기술로 전사 계수의 결합점과 DNA 의 개방성을 동시에 연구하는 데 사용할 수 있다. 초기 세포 복용량은 100- 1000 개 세포이다. ChIL-seq 는 전통적인 ChIP-seq 기술에서 항체 침전으로 인해 회수율이 낮은 결함을 피하며, 특히 벽세포에 적합하다. H3K4me3 및 H3K27ac 와 같은 활성 그룹 단백질 표지물의 경우 초기 세포 복용량은 단세포 수준까지 낮출 수 있습니다. [2]
원리: 세포를 96 오리피스 판에 추가하고, 고정과 염색 후 첫 번째 항체 을 추가하여 과녁 단백질을 결합한 다음, ChIL 프로브 (두 번째 항체 및 ChIL DNA 로 구성됨) 를 추가합니다. Tn5 회전효소를 통해 프로브의 ChIL DNA 를 과녁단백질의 게놈 DNA 근처로 통합한 다음 ChIL DNA 의 시동자를 통해 T7 RNA 중합효소를 작동시켜 전사하고, 게놈 DNA 를 템플릿으로 RNA 를 합성하고, DNase I 로 RNA 를 소화하고 절단하여 RNA 를 방출하고, 순화한 RNA 를 시퀀싱에 사용한다.
3. 칩 폐기:
물방울: 해상도가 단세포 수준까지 올라갈 수 있는 특수한 마이크로흐름 장치를 사용합니다. 이 기술은 단세포 수준에서 전사 인자 결합 부위와 그룹 단백질 손질을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 세포 특이성의 관점에서 세포 간 염색질의 변이 정도를 연구할 수 있다. 우리는 단세포 염색질과 단세포 표현 데이터의 통합으로 조절요소와 과녁 유전자가 더욱 정확하게 결합되고 기능 역학과 관계를 더 잘 이해할 수 있다고 생각한다. (윌리엄 셰익스피어, 단세포, 단세포, 단세포, 단세포, 단세포, 단세포, 단세포) [3]
원칙: 먼저 연구할 세포를 분해액과 MNase 를 섞어 염색질을 소화한다. 또한 다양한 커넥터가 포함된 물방울은 미세 유체 장치에서 반응하도록 설계되어 각 세포 방울과 커넥터 방울을 혼합하고 DNA 연결 효소가 포함된 버퍼 방울과 혼합합니다. 이 과정에서 커넥터 시퀀스는 끊어진 염색질 조각의 양끝에 자동으로 연결되어 세포 분열을 수행하고 특이항체 침전 목적 단백질을 이용하여 농축된 DNA 를 서열화한다. 기존의 게놈 서열과 비교해 보면 목표단백질의 작용 부위를 알 수 있다.
[1]. 1: 카야-오쿠호스, 우 SJ, 코도모카, 플레클스, 브라이슨 TD, 하이네코프, 아흐메드 k, 하이네코프 S.; 국가 공동체. 2019 04 29; 10 (1):1930.
[2].Harada A, Maehara K, Handa T, Arimura Y, Nogami J, Hayashi-Takanaka Y, Shirahige K, Kurumizaka H. 염색질 통합 표시 방법은 낮은 입력으로 게놈 분석을 할 수 있다. 자연 세포 생물학. 20 19 년 2 월 ： 2 1(2):287-296.
[3]. 로텐, 라모, 쇼레시, 스포린, 골란, 웨츠다, 번스타인. 단세포 칩-시퀀스는 염색질 상태에 의해 정의된 세포 하위 집합을 드러낸다. 나트 생명기술회사. 2065 438+05 nov；; 33 (11):1165-72