역유전학: 8-플라스미드 시스템으로 인플루엔자 A 바이러스를 구출

바이러스 게놈의 전체 길이 cDNA 복사본에서 바이러스를 생성하는 역유전학은 "감염성 복제"로 알려져 있으며 현대 바이러스학에서 가장 강력한 유전 도구 중 하나입니다. 재조합 DNA 기술을 사용하면 분자 수준에서 게놈을 분석하고 조작할 수 있습니다. 그러나 비레트로바이러스 RNA 바이러스의 경우 복제 중에 게놈이 DNA 단계에 들어가지 않으며 취약한 RNA 유전자를 직접 조작하는 것이 어렵습니다. 인플루엔자 바이러스의 게놈은 분할되고 음성 가닥이므로 인플루엔자 바이러스의 유전자 조작이 더 까다롭습니다.

전사 및 복제를 시작하기 위한 기능적 주형 역할을 하기 위해서는 인플루엔자 바이러스 RNA(vRNA)가 세 가지 바이러스 중합효소(PB2, PB1, 및 PA) 및 핵 단백질(NP). 인플루엔자 바이러스는 바이러스 복제 주기를 완료하기 위해 발현되고 포장되어야 하는 8개의 RNA 유전자 세그먼트로 구성된 게놈을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스의 역유전 시스템은 1999년 두 개의 서로 다른 연구 그룹에 의해 확립되었으며 인플루엔자 바이러스 RNA를 합성하기 위해 세포내 RNA 중합효소 I(Pol I)에 의존합니다. RNA 중합효소 I은 리보솜 RNA를 전사하는 풍부한 리보자임입니다. RNA 폴리머라제 I은 정의된 프로모터 및 터미네이터 서열에서 전사를 시작하고 종료하며, 생성된 전사체에는 5' 또는 3' 말단에 추가 뉴클레오티드가 포함되어 있지 않습니다. 따라서 이 효소는 핵에서 인플루엔자 바이러스 vRNA를 생성하는 데 매우 적합합니다. 인플루엔자 바이러스 구조 시스템이 지속적으로 개선되고 있지만, vRNA를 합성하기 위해 RNA 폴리머라제 I 시스템을 사용하는 기본 개념은 동일하게 유지됩니다.

현재 인플루엔자 바이러스의 새로운 합성은 주로 8-12개의 플라스미드로 세포를 형질감염시켜 달성됩니다. 그 중 8-플라스미드 시스템은 인플루엔자 A 바이러스를 구출하는 데 가장 광범위합니다. 8개의 플라스미드는 RNA 중합효소 I을 암호화하는 프로모터와 터미네이터를 포함하고 있으며, 각 인플루엔자 바이러스 분할 게놈에 대한 cDNA가 프로모터와 터미네이터 사이에 포함되어 있습니다. 8-플라스미드 시스템의 단백질은 Pol II에 의해 전사되고 번역되며, 이 시스템에는 최소한 4개의 단백질(PA, PB1, PB2 및 NP)의 발현이 필요합니다. 일반적인 8-플라스미드 시스템은 인플루엔자 바이러스의 8개 유전자를 전사하고 인플루엔자 바이러스의 10개 단백질을 번역할 수 있습니다. 완전한 인플루엔자 바이러스 단백질을 번역하면 인플루엔자 바이러스 구조 효율성을 향상시킬 수 있습니다.

프로토콜:

8-플라스미드 복제:

인간 polⅠ 서열을 포함하는 벡터를 구조 시스템의 발현 벡터로 사용하여 8-플라스미드 구조를 구성합니다. 체계. 이 벡터는 인간 pol I 프로모터와 마우스 pol I 종결 서열이 pol II 프로모터(CMV)와 종결 서열(SV40) 사이에 역방향으로 삽입된 양방향 이중 발현 벡터입니다. 인플루엔자 바이러스의 8개 cDNA(UTR 및 ORF 포함)가 벡터에 삽입됩니다. 세포에 형질감염시킨 후 pol I은 인플루엔자 바이러스 단일 가닥 음성 가닥 RNA를 합성하고 pol II는 인플루엔자 바이러스 양성 가닥을 전사합니다. mRNA를 생성하고 이어서 인플루엔자 바이러스 단백질을 번역합니다. 이 플라스미드는 삽입된 단편의 전후에 폴리A 꼬리가 있어서 범용 프라이머로 서열분석을 할 수 없기 때문에 각 유전자에 대한 특정 프라이머를 사용해야 합니다.

인플루엔자 A 바이러스 구출:

1. HEK-293T를 6웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 최소 95 confluence 동안 배양합니다.

참고: 형질감염에는 다량의 독성 형질감염 시약이 추가되므로 세포 상태가 양호해야 하며 필요한 양이 많습니다. 인간 pol I 프로모터의 종 특이성으로 인해 형질감염 효율이 높은 영장류 유래 세포(293T 또는 Vero 세포)만 인플루엔자 바이러스 포장에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 293T의 구조 효과는 Vero의 구조 효과보다 강력합니다. MDCK 세포는 많은 인플루엔자 바이러스의 성장을 지원하고 293T 세포와 동일한 배양 배지에서 성장할 수 있기 때문에 독점적으로 배양된 293T-MDCK 세포(1:1)를 사용하여 특정 인플루엔자 바이러스 균주의 구제 효율성을 향상시킬 수 있습니다.

2. DMEM 배양 배지(FBS 없음)에 각 플라스미드 1μg, 플라스미드 8개에 총 8μg을 추가하고 형질감염 시약과 혼합한 후 실온에서 15~30분 동안 방치합니다.

참고: 플라스미드: 리포솜=1:3; 플라스미드: PEI=1:4. DMEM은 Opti-MEM으로 대체될 수 있습니다.

3. HEK-293T의 DMEM 배지(FBS 함유)를 교체하고 플라스미드-형질감염 시약 복합체를 6웰 플레이트에 천천히 떨어뜨립니다.

4. 5% 이산화탄소가 들어 있는 37°C 배양기에서 세포를 배양합니다.

참고: 35℃ 환경도 허용됩니다.

5. 형질감염 24시간 후, TPCK 처리된 트립신을 최종 농도 1μg/ml로 첨가하고 계속 배양합니다.

참고: TPCK 트립신은 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질을 절단하여 바이러스를 감염성으로 만드는 데 사용됩니다. 일부 바이러스 균주에는 이 트립신이 필요하지 않습니다.

6. 형질감염 후 48시간 또는 72시간 후에 HEK-293T 세포 상청액을 수집합니다. 이때 인플루엔자 바이러스는 상층액에 존재하지만 역가는 극히 낮다.

참고: 세포를 세 번 냉동하고 해동하는 것을 반복하면 세포에서 인플루엔자 바이러스가 방출되는 데 도움이 됩니다.

7. 채취한 상층액을 MDCK 세포에 떨어뜨리면 인플루엔자 바이러스가 MDCK 세포에 감염되어 증폭됩니다.

참고: 최종 농도가 1μg/ml인 TPCK 처리 트립신을 추가하는 것도 필요합니다. 닭 배아에서 인플루엔자 바이러스 배양은 매우 효과적입니다. 9~11일 된 SPF 닭 배아에 접종합니다. 양막요막액은 배양 48시간 후에 채취되었습니다. 감염성 바이러스의 존재는 헤마글루티닌(HA) 테스트로 확인할 수 있습니다.

8. 감염 후 48시간이 지나면 MDCK 세포 상청액을 채취하고 플라크 분석을 실시하여 바이러스 역가를 결정합니다.

참고: 일반적으로 측정되는 역가는 약 5x10^6Pfu/ml입니다. 인플루엔자 바이러스 역가를 높이려면 계속해서 MDCK에 바이러스를 감염시켜 증폭시키십시오.

9. 8개의 바이러스 유전자 세그먼트 각각의 서열을 분석하여 구조 바이러스의 신원을 확인해야 합니다.

10. 바이러스액은 4℃에서 몇 주간 보관 가능합니다. -80℃에서도 장기간 보관이 가능합니다.

참고자료:

1. Liu Liqi, HgN2 조류 인플루엔자 바이러스의 병원성과 역유전 시스템 구축에 관한 예비 연구 [D], 2009.

2. Lee C W. 인플루엔자 바이러스의 역유전학[M]//동물 인플루엔자 바이러스, Humana Press, New York, NY, 2014: 37-50.