형광소 +ATP → 형광소 아실 아데노신산) +PPi
형광소 아데노신산 +O2 → 산소 형광소 +AMP+ 빛
이 반응은 매우 에너지 효율이 높아서, 입력 반응의 에너지는 거의 모두 빛으로 전환된다. 인간이 사용하는 백열등과 뚜렷한 대조를 이루는 것은 10% 이상의 에너지만 빛으로 변환되고 나머지 에너지는 모두 열로 변환되어 낭비된다는 것이다.
형광소 또는 형광소 효소는 특정 분자가 아니라 형광을 생산할 수 있는 모든 기질과 그에 상응하는 효소의 총칭이다. 비록 그것들은 다르지만. 빛을 조절할 수 있는 다른 생물은 다른 형광소 효소를 사용하여 다른 발광 반응을 촉매한다. 가장 널리 알려진 발광 생물은 반딧불이다. 그들이 사용하는 다른 형광소 효소는 다른 발광 생물의 형광소 효소와는 다르다. 예를 들면, Pleurotus ostreatus, Omphalotus olearius 또는 많은 해양 생물이 다르다. 반딧불이의 체내에서 발광 반응에 필요한 산소는 복부 기관지라는 파이프에서 수입한 것이다. 조두충과 같은 일부 생물은 여러 가지 다른 형광소 효소를 함유하고 있으며, 같은 형광소 효소 기질을 촉매하여 다른 색깔의 형광을 방출할 수 있다. 반딧불이는 2000 여 종이 있다. 하지만 무당벌레 총과에는 반딧불, 조반딧불, 관련 곤충 등 다른 곤충들이 많이 있기 때문에 형광소 효소는 분자계학에 매우 유용하다. 현재 가장 철저한 형광소 효소는 Photinini 반딧불이과에서 온 북미 반딧불이다.
형광소 효소
일명 발광 효소는 생물 발광을 촉진하는 효소 시스템의 총칭이다. 그것은 일종의 고분자 성분으로, 경물질의 냉수 추출물이 산소에서 빛을 발하고, 밑물 형광소가 소모된 후 열에 불안정하다. 현재 가장 많이 연구되고 있는 것은 반딧불이와 발광 세균 형광소 결정체이다. 그것들은 가산소효소에 속하며 금속과 코엔자임은 함유되어 있지 않다. 빛을 내기 위해서, 일부 효소는 반드시 ATP 를 보조요인으로 해야 한다. 다른 사람은 없다. 반딧불의 발광 메커니즘은 종에 따라 크게 다르다는 것은 잘 알려져 있다. 형광소 효소는 고도의 특이성을 가지고 있으며, 보통 관련 종의 형광소 효소에만 작용한다. 물론 반딧불이와 반딧불이의 효소는 서로 교체하여 빛을 발할 수 없다. 반딧불이의 반딧불 효소는 건조한 상태에서 상당히 안정적이어서 보존할 수 있다.
쌍형광소 효소 보고 유전자 검출: 반딧불이와 해양강장동물 형광소 효소를 결합한 선진 * * * 보고 유전자 검출 기술
반딧불 형광소 효소가 정량 유전자 표현에 사용될 때, 일반적으로 두 번째 보고 유전자를 사용하여 실험에서 변이 요인을 줄인다. 그러나 기존의 * * * 보고 유전자 (예: CAT, β-Gal, GUS) 는 각기 다른 테스트 화학, 처리 요구 사항 및 검사 특성으로 인해 편리하지 않습니다. Promega 는 고급 이중 보고 유전자 기술을 제공한다. 반딧불 형광소 효소 실험과 해양강 장동물 형광소 효소 실험, 쌍형광소 효소 보고 유전자 검사 시스템, pRL 전달체 시스템, 2 차 보고 유전자 해양강 장동물 형광소 효소 표현, 단일 튜브에서 쌍형광소 효소 보고 유전자 검사, 빠르고 예민하며 간편합니다. 이 시스템은 또한 PLB 분해물을 제공하여 단일 샘플을 조작하지 않고 다공판에서 배양된 포유류 세포를 분해합니다. 반딧불 형광소 효소를 사용하여 유전자 벡터를 보고하는 연구원들에게 .....
소개하다
이중 보고 유전자는 실험 시스템의 관련 또는 비례 검사에 사용되며, 일반적으로 한 보고 유전자는 내부 대조군으로 사용되어 다른 보고 유전자의 검사가 일관되도록 합니다. 유전자 발현을 검출 할 때, 배양 된 세포를 즉각적으로 형질 감염시키기 위해 일반적으로 이중 보고 유전자를 사용하며, 실험보고 유전자를 갖는 벡터는 다른보고 유전자를 갖는 두 번째 벡터를 대조군으로 형질 감염시킨다. 일반적으로, 실험은 유전자가 조절된 시동자와 짝을 이룬다고 보고한다. 조절 유전자의 구조와 생리적 기초를 연구하다. 유전자 표현 활성성의 상대적 변화를 보고하는 것은 연합조절 시동자 전사 활성성의 변화와 관련이 있다. 구성형 시동자와 짝을 이루는 두 번째 보도 유전자는 전사 활성화에 대한 내부 통제를 제공하므로 실험은 실험 조건의 변화에 의해 방해받지 않는다.
이 방법을 사용하면 세포 배양의 양과 활력, 세포 전염과 분열의 효율성 차이와 같은 내부 변화 요인에 의해 약화되는 실험의 정확성을 낮출 수 있습니다.
최근 반딧불 형광소 효소와 염소마이신 아세틸 전이효소 (CAT), β-반유당 글루코시다 제 (베타-gal) 또는 포도당알데히드산 효소 (GUS) 의 쌍보고 유전자가 결합되어 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 이중 보고 유전자의 조합은 형광소 효소 테스트와 정량과 같은 형광소 효소 조작의 장점을 몇 초 안에 할 수 있지만 CAT, 베타-gal, GUS 테스트 방법, 또한 이러한 보고 유전자는 민감도와 선형 반응 범위에 의해 제한되므로 이러한 범위를 초과하지 않도록 주의해야 하며 내원성 세포 활력도 이러한 보고 유전자의 사용을 방해할 수 있습니다. 많은 종류의 세포는 내원성 플루토늄이나 β-Gal 표현을 가지고 있는데, 이는 보고 유전자의 정확한 정량 표현에 불리하다. 세포 내 탈 아세틸 화 효소 활성은 고양이 활성 시험을 방해합니다. 고온 사전처리 세포 분해액 (1, 2) 은 내원성 β-Gal 과 CAT 실험의 간섭을 줄이지만, 이러한 처리로 형광소 효소가 빠르게 비활성화된다. 따라서 이 쌍보고 유전자 검사에서 * * * 로 전염된 세포 분열물을 다른 단계에서 처리해야 한다.
이상적인 이중 보고 유전자 방법을 통해 사용자는 반딧불 형광소 효소의 속도, 민감도, 선형 범위로 동일한 샘플 중 두 가지 보고 유전자를 동시에 측정할 수 있어야 합니다. CAT, 베타-gal, GUS 와 같은 전통적인 보고 유전자에서는 불가능합니다. 테스트 화학에 내재되어 있는 한계이기 때문입니다. 반면 firefly (Pyraris) 와 Renilla reniformis 를 결합하면 Promega 의 이중 형광 효소 보고 유전자 테스트 (DLR) 시스템이 이러한 요구 사항을 충족하고 단일 시험관에서 테스트를 완료할 수 있습니다.
Double fluorescein 효소 보고 유전자 검사 화학
반딧불이와 해양강장동물 형광소 효소는 모두 생물 발광 보고 유전자의 우수한 테스트 특성을 가지고 있지만, 진화의 기원은 다르기 때문에 효소 구조와 기질 요구 사항이 다르다. 이러한 차이는 DLR 테스트 화학을 개발하고 이 두 생물 발광 보고 유전자의 활성화를 선별적으로 구분하는 데 사용됩니다. 반딧불 형광소 효소는 6 1kDa 야키를 가진 단백질이다. 효소 활성은 번역 후 유전자 보고 유전자로 사용할 수 있으며, 번역 후 손질할 필요가 없다 (3, 4). ATP, Mg 2+ 및 O 2 의 존재로 딱정벌레 형광소의 산화반응을 통해 빛을 발한다 (그림 1). 통상적인 반응 조건 하에서 형광소가 산화될 때 형광소 -AMP 를 중간체로 하는 변환이 매우 느리다. 그 결과, 기질과 효소가 혼합된 후, 테스트 화학은 빠르게 감소하는 "반짝임" 빛을 생성합니다. 특허를 받은 테스트 시약, 반딧불 형광소 효소의 활성화를 정량화하고, 코엔자임 A(CoA) 를 첨가하여 빠른 효소 전환을 강화함으로써 반응역학 (5) 을 개선함으로써 연속적인' 깜박임' 발광 신호를 생성할 수 있다 (그림 2).
그림 1 반딧불이와 해신반딧불이효소가 촉발하는 생물발광
해양강장효소는 천연원 신장형 신장에서 순화한 36 kDa 단백질로 3% 의 탄수화물을 함유하고 있다. 하지만 반딧불 형광소 효소처럼 그 활성성은 번역 후 변형 없이 유전보고 유전자로 사용될 수 있다. 해양강장효소가 촉발하는 발광반응, O _ 2 와 강장소 (그림 1) 를 사용하여 DLR 테스트 화학이 실험에 사용될 때 해양강장소 반응의 역학은 깜박임 발광 신호를 발생시켜 감지 과정에서 천천히 감쇠한다 (그림 2).
DLR 테스트 시스템에서 반딧불이와 해양강장동물의 형광소 효소 활성은 단일 분해물로 점진적으로 측정된다. 반딧불 형광소 효소 활성 ('실험' 보고 유전자) 측정 후 반딧불이의 발광은 빠르게 인멸되고 해양강 장동물 형광소 효소의 발광반응은 활성화 ('대조' 보고 유전자) 된다. 따라서 DLR 테스트 시스템은 두 가지 테스트 화학 물질을 통합하여 신속하게 * * * 표현하는 두 가지 보고 유전자를 통합했습니다.
반딧불 형광소 효소 실험의 선형 범위는 효소 농도의 8 개 수량급까지 뻗어 있으며, 실험 보고 유전자 효소 ≤ Kloc-0/FG (약 10 -20 mol) 를 측정할 수 있다 (그림 3A). 쌍형광소 효소 보고 유전자 검출 시스템을 이용하여 해양강장동물 형광소 효소의 선형 범위는 효소 농도의 7 개 규모, 하한선10FG 에 이른다.
쌍형광소 효소 보고 유전자로 반딧불이와 해신 형광소 효소의 발광을 검출하다. CHO 세포를 pGL3 으로 형질 감염시켰다 (1× 10 6 /60mm 배양판).
대조군과 pRL SV40 벡터 DNA. PBS 로 세포를 씻은 후 400μl PLB 를 넣어 분해물을 준비한다. 20μl 소세포 분해액을 100μl 형광 효소 테스트 시약 II(LARII) 와 혼합하면 형광 광도계는 반딧불 형광소 효소의 활성 (가는 선 추적) 5438+000 μ L Stop &; Glo TM 시약 을 형광조도계 의 관 에 넣어 반딧불 형광소 효소 반응 을 없애고 동시에 해신 형광소 효소 반응 을 활성화하고 즉시 해신 형광소 효소 활성 (굵은 선 추적) 을 검출 했 다. Turner Designs 20/20 형 형광조도계에는 형광 방출을 추적하기 위한 컴퓨터가 장착되어 있으며, 이 테스트는 65438 02 초 이내에 두 번 완료됩니다.
Double fluorescein 효소 보고 유전자 검출 시스템 방법
분해용액을 준비한 직후 두 개의 유전자를 보고하는 형광소 효소의 발광 신호를 정량할 수 있으며 샘플을 그룹으로 나누거나 추가 처리를 할 필요가 없다. 해양강장동물과 반딧불 형광소 효소가 모두 깜박임반응역학을 보이기 때문에 쌍형광소 효소는 유전자 테스트에 시약 주사기가 있는 형광조도계가 필요하지 않다고 보고했다.
일반적으로 DLR 테스트를 완료하는 데 약 30 초가 걸립니다 (그림 4 참조). 반딧불 형광소 효소가 유전자 테스트를 보고할 때 분해산물을 형광소 효소 테스트 시약 II (LAR II) 와 섞는다. 반딧불 형광소 효소 실험을 완료하면 반딧불이는 발광하여 소멸되고, 해양강 장동물 형광소 효소 발광이 활성화되어 & amp；; Glo TM 시약 샘플 튜브. 1 초 이내에&;를 중지합니다 Glo TM 시약 1.05 보다 큰 반딧불 반응 발광 신호 (그림 5) 를 인멸하고 해양강 장동물 형광소 효소를 활성화시킨다.
그림 3 반딧불 형광소 효소와 해신 형광소 효소 발광 반응의 선형 범위. 순화된 반딧불이와 해신 반딧불 효소는 1mg/ml BSA 가 함유된 1×PLB 로 지속적으로 희석된다. 컴퓨터가 장착된 Turner Designs 형광도계는 65438 00 초의 총 형광을 감지하는 데 사용됩니다. 처음 2 초의 사전 읽기 지연 후 두 가지 고농도 형광소 효소의 발광반응을 직접 감지할 때 형광조도계의 샘플실에 중성 밀도 필터를 넣는다. 10fg 및 100fg 를 포함하는 해신 반딧불 효소 반응에서 해양 내강 반딧불 효소 자체 발광의 배경 신호를 뺀 것이다. 두 가지 형광소 효소의 발광 활성성은 각각의 테스트 변화 농도에 상대적으로 그래프로 그려진다.
그림 4. 수동 형광조도계 또는 시약 샘플러가 장착된 형광조도계로 이중 형광소 효소 실험을 하는 방법. 예를 들어 형광 조도계에 두 개의 샘플러가 장착되어 있는 경우 분해물은 형광 조도계의 튜브에 미리 포장되어 있으며, 그런 다음 형광 효소는 시약 II (LAR II), stop & amp；; GloTM 시약.
PLB 분해물
PLB 분해액 완충액, 특별히 설계된 포유류 세포는 벽세포나 융해순환을 긁지 않고도 효과적으로 분해될 수 있습니다. PLB 는 수동 분해 과정을 위해 설계되었지만, 신뢰할 수 있는 분해 효과도 통상적인 처리 방법을 통해 준비한 분해물에 도움이 됩니다. 어떤 분해 방법을 사용하든 배양된 포유류 세포에 대해 PLB 분해액에 방출된 반딧불이와 해양강장동물효소 보고효소는 모두 정량적이고 믿을 만하다 (그림 6). 수동적 분열물의 뚜렷한 장점 중 하나는 낮은 수준의 비효소 발광 (자체 발광) 을 억제할 수 있다는 점이다. 이는 해양강장동물이 수용액에 내재하는 특징이다. 세포 분열액을 준비하는 데 자주 쓰이는 시약, Triton 을 포함한 해양강장동물의 자체 발광을 증강시킬 수 있습니까? X- 100, Promega 의 세포 배양 분열 실험? (CCLR) 과 보고 유전자 절단 시약 (RLB) 도 해양강 장동물 형광소 효소의 발광반응을 현저히 억제한다. PLB 는 형광소 효소 활성을 극대화하고 자체 발광을 최소화하도록 설계되어 최적의 테스트 감도를 제공하고 매우 낮은 수준의 해양강 장동물 형광소 효소를 정량한다. 또한 PLB 는 물집이 생기는 것을 억제하는데, 이는 고통 어플리케이션에 매우 적합하며, 자동 시스템에서 다공판에서 배양된 세포군을 분해물로 준비하고 테스트하는 데 사용할 수 있다.
그림 5 쌍형광소 효소 보고 유전자 테스트 시스템은 반딧불 형광소 효소 발광을 없애고 해신 형광소 효소 발광을 활성화시킨다. CHO 세포 분열물에는 * * * 전염된 pgl 3- 대조와 pRL SV40 전달체 DNA 가 포함되어 있으며 그림 2 에 설명된 방법에 따라 준비됩니다. 반딧불 형광소 효소 (보고 유전자 1) 와 해신 형광소 효소 (보고 유전자 2) 의 활성을 10 초 안에 검출한다. Glo TM 시약 인멸보고 유전자 1 의 효율성, 등체적인 stop & amp； 추가 Glo TM 시약 (해양강장소가 없어 해신 반딧불 반딧불 효소 반응이 활성화될 수 없음), 반딧불 반딧불 반딧불 반딧불 효소 발광은 인멸되고 해신 반딧불 효소 발광은 활성화되지 않는다. 이 실험에서 소멸된 반딧불 형광소 효소 반응의 잔여발광은 손상되지 않은 반응값의 0.0004% 보다 작다.