전체 유전자 합성 기술은 이미 매우 성숙했으며, 일반적인 방법은 합성이 겹치는 단일 체인 과뉴클레오티드를 설계하여 겹치는 확장 PCR 을 통해 전체 길이를 접합하는 것이다. 인터넷에는 전체 유전자 합성 방법에 대한 많은 정보가 있으며, 단일 전체 유전자 합성과 관련된 특허는 수백 개이다. 흔히 볼 수 있는 것은 중첩 확장 PCR(OE-PCR), 이중 비대칭 PCR(DA-PCR) [2], 폴리효소 체인반응 (PCR) [3], 연결효소 체인반응 (LCR) [4]; 솔직히 말해서, 나는 이 방법들을 자세히 연구한 적이 없다. 이름이 무엇인지는 중요하지 않습니다. 항상 동일합니다. PCR 은 겹치는 짧은 프라이머를 기반으로 중합 효소를 통해 성장 세그먼트를 점진적으로 확장합니다.
전체 유전자를 합성하는 가장 쉬운 방법은 무엇입니까?
물론 DNA 합성회사를 합성하게 합니다. 우리는 단지 DNA 서열 정보만 제공하면 된다. 그들은 dsDNA 를 합성하고 범용 벡터에 복제하며, 일반적으로 합성의 정확성을 보장하기 위해 시퀀싱 정보를 제공합니다. 이것은 의심할 여지없이 가장 간단하고 편리한 방법이다. 그리고 지금 전체 유전자 합성은 매우 싸다. 1bp 는 1 달러도 안 된다.
DNA 합성회사가 이렇게 편리한데 왜 스스로 합성해야 하나요?
① 회사 합성이 느려서 보통 1-2 주가 필요하다. 대장균에 대한 독성이 매우 큰 코드화 서열과 같은 특수한 서열을 만나면 주기는 말하기 어렵다. (나는 핵산효소를 만들었는데 합성회사는 한 달 동안 만들지 않았다. 나 혼자 일주일 만에 해냈다.) (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 성공명언)
② 자유롭지 않다. 일반적으로, 목적유전자를 휴대하는 재조합체는 합성회사에서 제공한다. 얻은 후에는 효소로 잘라야 한다. 유전자에 효소 절단 부위가 포함되어 있다면 피해야 한다. 물론 이것들은 일반적으로 큰 문제는 아니지만, 너는 정말 방법이 없다.
(3) 앞서 언급한 바와 같이, 전체 유전자 합성은 일반적으로 이원 유전자 표현에 사용되며, 이원 표현의 대상은 대부분 효소이며, 효소의 성질을 연구하기 위해 대량의 돌연변이를 구축해야 할 수도 있다. 합성회사는 하나의 서열만 제공하며 돌연변이는 디자인 유인물을 통해 재구성해야 한다. 전체 유전자가 스스로 합성되면 돌연변이가 포함된 유인물을 대체함으로써 다양한 돌연변이를 동시에 얻을 수 있어 대량의 돌연변이가 포함된 돌연변이를 만들 때 더욱 유리하다.
순서는 기밀을 유지해야 하는데, 결국 너는 가장 믿을 만하다.
항상 자신의 풍족한 음식을 좋아하는 사람이 있다. 이 글에서는 자기종합적인 방법을 소개하고 두 가지 방법을 소개하겠습니다.
브리지 PCR 기반 1 1 회용 접합 방법
이 방법은 프라이머 사이의 상호 어닐링에 의존하여 서로 템플릿으로 확장되므로 필요한 프라이머는 항상 양수와 음수입니다. 우선 유전자 서열 전체를 단과뉴클레오티드로 끊는 것은 보통 59bp 를 넘지 않는다. 일반 프라이머 합성은 모두 59bp 를 분수령으로 하고 59bp 를 넘는 가격과 시간 비용이 훨씬 높기 때문이다. 과뉴클레오티드와 3' 끝의 상보성 서열은 퇴화하여 간격이 있는 쌍사슬 산물을 형성한 다음, 그 틈새는 DNA 중합효소에 의해 보충되어 간격이 있는 DNA 쌍사슬 산물을 형성한다. 이 제품은 Taq DNA 연결 효소를 통해 완전한 이중 체인 제품을 형성하여 템플릿으로 PCR 증폭을 수행하고, 목적 유전자를 얻거나, 간격이 있는 DNA 이중 체인을 템플릿으로 직접 PCR 증폭시킬 수 있습니다.
2 단계별 확장을 기반으로 한 단계별 접근 방식
이 방법에서는 마지막 프라이머만 반전되고, 다른 것은 전방향이며, 정방향 프라이머 사이에는 겹치는 시퀀스가 있습니다. 끝에서 두 번째 과뉴클레오티드와 끝에서 두 번째 과뉴클레오티드는 말단 상보성 서열을 통해 서로 퇴화한다. 첫 번째 PCR 주기 이후 이중 체인이 확장되고, 확장된 이중 체인과 끝에서 두 번째 oligo 가 전체 길이 시퀀스가 합성될 때까지 계속 퇴화하고 확장됩니다. 이론적으로 PCR 루프는 하나의 프라이머만 확장할 수 있으며, N 개의 oliogs 는 최소한 N 개의 PCR 루프를 거쳐야 합니다. 하나의 확장 끝만 있기 때문에 프라이머 설계는 방법 1 보다 간단하므로 프라이머 수에는 짝수가 필요하지 않습니다.
1. 디자인 PCR 프라이머.
자동 설계 도구를 사용하거나 수동으로 설계할 수 있습니다. 자세한 내용은 뒷부분에서 설명합니다. 수동으로 설계한 경우 SnapGene 을 사용하는 것이 좋습니다. (이 소프트웨어의 강력함은 말할 것도 없고, 인터넷에 해독판이 많이 있다는 것을 알아야 하며, 바이두에 가는 척 하지 않는 것이 좋습니다.) 전체 유전자 서열 복사가 끝나면 먼저 Preferences 패널을 호출하여 Primer 옵션을 찾아 3' 끝의 가장 짧은 일치 길이와 가장 낮은 Tm 을 각각 10bp 및 40 으로 설정합니다.
3'- 말단이 잘못 짝을 이루는 이 글의 전체 유전자 합성 방법은 매우 불리하기 때문에, 이 두 가지 설정이 너무 낮아서 유인물을 설계하기가 어렵다면 12bp, 45 C 로 적당히 올릴 수 있다. 그렇지 않으면 코돈 최적화 후 재설계만 할 수 있습니다.
프라이머 길이는 기본적으로 59bp 로 설정되어 있으며 겹치는 영역의 설계에 중점을 둡니다. 일반적으로 겹치는 영역의 Tm 에 따라 결정됩니다. 서로 다른 겹치는 영역 간의 Tm 균형은 매우 중요합니다. Tm 은 3 C 를 초과하지 않으며 Tm 을 55 C 에서 58 C 사이로 설정하는 것이 좋습니다. 이 글의 첫 번째 방법의 경우, 유인물의 수는 짝수여야 하며, 시퀀스부터 하나, 다음 과뉴클레오티드의 시작점은 이전 중첩 영역의 끝점이고, 위는 직선이고, 아래는 반대여야 한다는 점에 유의해야 한다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 성공명언) 마지막 숫자가 홀수인 경우 마지막 몇 개의 프라이머 길이를 조정하여 역방향 프라이머를 만들어야 합니다.
두 번째 방법의 경우, 시퀀스의 시작 부분에서 앞으로 나아가는 방향을 잡아당기고, 나머지 모든 것은 반대 방향으로 끝나거나, 끝 부분에서 반대 방향을 당길 수 있고, 나머지는 시작까지 앞으로 나아갈 수 있습니다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 성공명언) 이 방법은 프라이머의 수에 관심이 없다.
PCR 을 통해 전체 길이 제품을 얻습니다.
일반적으로 PCR 2 라운드가 필요합니다. 첫 번째 라운드에는 소량의 프라이머가 추가되어 50uL 시스템에서 0.5- 1pmol/ oligo 및 10- 15 개의 루프를 통해 전체 길이 템플릿을 얻을 것을 권장합니다. 이번 PCR 에서 추천하는 DNA 중합 효소는 3'-5' 와 5'-3' 핵산 외체효소 활성을 동시에 잃으면 겹치는 영역의 Tm 균형을 파괴한다. 2 라운드는 1uLPCR 산물을 템플릿으로 20pmol 전체 길이의 상류 및 하류 유인물을 넣고 20 ~ 25 개의 순환을 통해 목적 유전자를 얻는다. 이 PCR 라운드는 하이파이 DNA 중합 효소를 사용해야 한다.
발현 벡터에 복제.
동원재편성, 제한적 내체효소 연결 등을 통해 목적유전자를 전달체에 삽입해 대장균이나 기타 숙주 감각 세포를 변형시켜 단일 복제를 얻는다. 전체 유전자 합성을 하기 전에 복제/표현 벡터에 대한 상동암 또는 제한 부위를 설계하고 유전자 서열 전체에 직접 추가하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 유인물을 별도로 설계하여 상동암 또는 제한 부위를 추가해야 합니다.
4. 시퀀싱 및 식별
양성 복제는 PCR 에 의해 확인되고 시퀀싱됩니다. 올바른 클론은 다운스트림 표현 및 정제에 사용할 수 있습니다.
최적화 프로그램: /gems, 열 수 없습니다.
GeneDesign [12]: 게놈 연구에서 나온 것입니다. 논문의 링크는: /tools/ 104.html 입니다. 분명히 열릴 겁니다. 이것은 코돈 분석과 최적화, 유전자가 자동으로 올리고 뉴클레오티드로 변환되어 참조 실험 방안을 생성하는 등 내가 직접 쓴 도구이다. 결과 올리고머는 길이가 균일하고 겹치는 영역의 Tm 값이 같습니다. Tm 계산 공식은 Tm = 64+0.4 1×GC-528/n 입니다. 구체적으로 제 PCR 프라이머 설계 방법을 참고하세요. 생성된 oligo 는 oligo+ 일련 번호+공백 +Tab+ 시퀀스 (5'-3') 형식으로 원클릭 복사할 수 있으며 SnapGene 으로 직접 가져올 수 있습니다.
내 프로그램 출력의 프라이머는 SnapGene 에 의해 인식될 수 있다. 메뉴모음에서 "인용 도구" 를 클릭하고 "목록에서 인용 가져오기" 옵션을 클릭하여 클립보드에서 시퀀스 가져오기를 선택합니다.
각 프라이머가 대상 시퀀스를 완전히 덮어쓰는지, 프라이머의 "머리와 꼬리" 가 충돌하는지 등을 확인할 수 있습니다.
GFP 를 타겟 시퀀스로 사용하여 테스트:
1 NCBI 녹색 형광 단백질의 순서를 찾아 텍스트 상자에 붙여 넣습니다. 첫째, 코돈 선호도를 분석하십시오.
대장균의 희귀 코돈은 붉은색으로 표시되어 있는데, 이는 GFP 천연 유전자에 희귀한 코돈이 많이 들어 있어 코돈 최적화를 먼저 할 수 있다는 것을 보여준다.
② 올리고머 생성에는 두 가지 방법이 있습니다. 기본값은 방법 1 입니다. 유인물의 유사성이 높은 경우 방법 2 를 사용하라는 메시지가 표시됩니다.
과뉴클레오티드 생성 버튼을 클릭하면 총 염기 수에 대한 통계가 나온 다음 과뉴클레오티드 일련 번호와 시퀀스를 출력하고 실험 방안 버튼과 복사 버튼을 동시에 생성합니다. 원클릭 복제 후 SanpGene 분석으로 가져올 수 있습니다.
③ 유전자 분석
GFP 유전자는 완전히 덮여 있고, 유인물도 있고, 유인물 사이의 Tm 은 기본적으로 일치한다. (프로그램과 SnapGene 의 Tm 알고리즘이 일치하지 않기 때문에 SnapGene 에서는 기본적인 일관성만 볼 수 있다.
(4) 실험 프로그램 생성
보통 체외 총 유전자 합성은 한 번에 1000bp 를 초과하지 않는다. 일회성 합성이 너무 길면, 실수할 확률이 높아진다. 800bp 세그먼트를 추천합니다. 프로그램은 입력한 시퀀스 길이에 따라 세그먼트 수를 추천합니다.
이 도구가 전체 유전자 합성을 완료하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다. 보조 벡터로 만든 도구도 썼습니다. 나중에 소개하겠습니다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 유전명언)
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