정주동창익생식품유한공사가 제공하는 콩분리단백질 Novozyme 에서 제공하는 알칼리성 단백질 효소 (2.4AU/g), 풍미복합효소 (500LAPU/g), 복합효소 (1.5AU/G); 광서남닝제보 생물제품유한공사에서 제공하는 파파인 (600,000U/G); 광저우 도요타 화공유한공사에서 제공하는 파인애플 단백질 효소 (2500 GDU); 펩신 (1: 10000), 트립신 (250). U.F.U/mg) 와 리놀레산 (분석순) 은 적마가 제공합니다. 인산염 완충액 (pH9.35), FeCl2-EDTA 용액 (0.05mol/L), FeCl2 용액 (0. 1mol/L), KSCN(40%
1.2 기기
자외선-가시분광 광도계, 초음파 세척기, 원심분리기, pH 산도계, 케이드정질소계, 증압전기믹서, 전기온온수욕냄비, 항온건조함.
1.3 실험 방법
1.3 의 질소 함량 측정
케씨 정질소법 (GB/T5009.5-2003).
1.3.2 콩 펩타이드 용액의 제조
4%(W/V) 콩단백질 용액을 준비하여 신속하게 80 C 로 가열하고, 80 C 수욕에서 65438±00min 을 가열한 다음 효소의 최적 수해온도로 냉각시켜 온도와 교반속도를 그대로 유지하고, NaOH(HCl) 표준 용액으로 용액의 pH 값을 유지한다. 비례에 따라 프로테아제를 따서 콩단백질 용액에 넣고 타이밍을 시작한다. 반응 과정에서 적시에 NaOH(HCl) 표준용액을 넣어 pH 를 일정하게 유지하고, 예정된 반응시간에 일정 부피의 용액을 추출한 다음 신속하게 85 C 소화 효소 438±00min 으로 가열한다. 냉각 후 5000 회전/분 원심분 65438 00 분, 상청액을 취해 수해도와 항산화치를 측정한다.
1.3.3 가수 분해도 측정 [4]
H = (a ×10-3 ×10)/(14 × 0.1))
Ho=4%×7.75=0.3 12 (밀리몰/밀리리터)
DH(%)=h/ho=23A (1)
참고: h: 콩 펩타이드 용액 -NH2 농도 (mmol/ml)
Ho: 단백질 용액에서 펩타이드 결합의 등가 농도 (mmol/ml)
A: 콩 펩타이드 용액의 질소 농도 (마이크로 그램/밀리리터)
1.3.4 프로테아제 가수 분해 매개 변수 결정
단백질 분해 속도와 단백질 가수 분해 정도에 영향을 미치는 주요 매개 변수는 온도, pH 값, 기질 농도, 효소 농도 및 시간입니다. 가수 분해도를 지표로, 단일 요소 실험을 통해 매개변수의 최적 값을 결정하고, 직교 실험을 통해 요소 조합을 최적화함으로써 프로테아제의 가수 분해 매개변수를 결정합니다.
1.3.5 콩펩티드의 항산화 값 결정 [5]
참고 문헌 [5] 은 콩 펩타이드의 항산화 값을 측정하고 적절하게 수정하는 데 사용됩니다.
100 ml 리놀레산 원액, 300ml 0.05mol/L 의 FeCl2-EDTA 용액과 500ul 콩펩타이드 용액을 작은 송곳병에 넣고 골고루 섞어서 50 C 에서 4 시간 동안 빛을 피한 다음/KLOC 를 꺼냅니다. 1000 ul 40% KSCN 용액을 넣고 섞어서 130ul 을 건조 시험관에 넣고 6ml 에탄올 (75%, 0.3mol/L HCl 포함) 을 넣는다. 가수 분해되지 않은 콩 단백질 반응액의 흡광값은 공백이며 상대 항산화 값은 1 입니다.
상대 항산화 값 = 가수 분해되지 않은 단백질 용액의 흡광값/콩펩티드 용액의 흡광값
2 실험 결과
2. 1 질소 함량 표준 곡선
분광 광도계 (580nm) 에서 측정한 다양한 농도의 글리신 작동액의 흡광도 값은 그림 1 에 나와 있습니다.
질소 함량과 흡수값 사이의 회귀 방정식은 다음과 같습니다.
Y =1.3342x+0.0133 (2),
회귀 계수는 R2=0.998 입니다.
등식 (2) 의 역함수는 x=0.425y-0.0095(3) 입니다.
등식 (3) 에서 x 의 값을 등식 (1) 에서 a 의 값으로 대체합니다.
DH(%)=0. 17y (4).
2.2 프로테아제 효소 가수 분해 매개 변수 결정
가수 분해도를 지표로 하여 단일 요소 실험 (편폭, 특정 데이터 생략) 을 통해 매개변수 범위를 결정하지만 직교 실험을 통해 요소 조합을 최적화합니다. 7 가지 프로테아제 매개 변수의 최적 조합은 표 1 에 나와 있습니다.
표 1 7 가지 프로테아제 가수 분해 매개 변수의 최적 조합
온도 (℃) pH 기준 농도 (%) 효소 농도 (%) 시간 (분)
알칼리성 효소 60 8.0 3 0.5 60
풍미효소 50 7.0 4 6 30
복합효소 45 7.0 4 6 20
파파인 55 7.5 5 3 40
파인애플효소 65 8.0 5 6 30
펩신 37 2.5 4 2 30
트립신 가수 분해도 50 7.0 5 3 302.3 콩 펩타이드 용액
2.3. 1 콩 펩타이드 용액의 흡광도 값
분광 광도계 (580nm) 로 측정한 단백질 분해 효소에 따라 가수 분해되는 다양한 농도의 콩펩티드 용액의 흡광도 값은 표 2 에 나와 있으며, 가수 분해되지 않은 단백질 용액의 흡광도 값은 0. 178 이다.
2.3.2 대두 펩타이드 용액의 가수 분해도
표 2 의 흡광도 값을 대입식 (4) 으로 대입하여 해당 콩펩티드 용액의 수해도를 얻은 결과 그림 2 와 같이 단백질 분해 효소가 가수 분해되지 않은 콩단백질 용액의 수해도는 3.03% 였다.
그림 2 에서 볼 수 있듯이, 7 종의 단백질 분해 효소에 의한 콩단백질의 가수 분해 정도는 가수 분해 시간 연장 (4 시간 이내) 에 따라 증가하지만, 가수 분해 속도는 커지기 시작한 다음 점차 작아진다. 그중 알칼리성 단백질 효소의 가수 분해 능력은 다른 6 가지 단백질 효소보다 강하다.
2.5 대두 펩타이드 용액의 항산화 값
리놀레산 완충액과 콩펩티드 혼합 용액 항산화 실험 후 분광 광도계로 48 1nm 에서 흡광도를 측정한 다음 콩펩티드 용액의 상대적 과산화 값을 계산하고 상대적 과산화액으로 콩펩티드의 항산화 능력을 나타낸다. 결과는 그림 3 과 같습니다.
표 2 다른 프로테아제 가수 분해물에서 콩 펩타이드 용액의 흡수 값
광 흡수 값
1(1h) 2 (2h) 3 (3h) 4 (4h)
알칼리성 효소 0.605 0.705 0.975 0.985
풍미효소 0.545 0.632 0.877 0.909
복합효소 0.487 0.532 0.587 0.627
파파인 0.340 0.349 0.355 0.4 12
파인애플효소 0.422 0.474 0.708 0.808
펩신 0.23 1.243 0.293 0.299
췌장 효소 0.462 0.583 0.599 0.603 그림 3 에서 볼 수 있듯이, 단백질 분해 효소 가수 분해 콩 펩타이드 용액의 항산화 능력은 효소 분해 시간 연장 (4 시간 이내) 에 따라 빠르게 증가한 다음 천천히 증가하거나 심지어 멈추는 것으로 나타났다. 이 7 가지 효소 중 알칼리성 단백질 효소가 가수 분해되는 콩펩티드 용액의 항산화치가 가장 크다.
3 결론
(1) 콩은 항산화 활성을 가지고 있으며, 단백질 효소에 따라 준비한 콩의 항산화 능력도 다르다.
(2) 연구한 7 가지 프로테아제 중 알칼리성 단백질 분해 효소가 콩펩티드를 가수 분해하는 능력이 가장 강하고 항산화 수치가 가장 크며 최고의 효소가 되어야 한다. 참고
[1] 첸 H M, 마을 본 K.Y, 다나카 f 등. 콩단백질 소화물에서 발견된 플루토늄 조각에서 추출한 트립토판의 항산화 특성. 음식. 화학, 1998, 46:49-53.
장설중. 콩 펩타이드 가공 기술의 원리와 응용 베이징: 과학기술문헌출판사,1999:181-200.
[3] 진미정. 콩단백질 분해물이 히드 록실 라디칼을 제거하는 연구. 식품과학, 2002,23 (1); 43-47.
[4] 호, 장디칭. 건강 식품 화학 및 시험 기술. 베이징: 중국 경공업 출판사.
[5] Adler-nissen J. 식품 단백질의 효소 가수 분해. 에스웰 응용과학출판사. 뉴욕, 1986:74-78.
* 프로젝트 지원: 허난성 중점 기술 공관 프로젝트 (05230 1 1700).
저자 소개: 황계 (197 1 ~), 남자, 하남 여남인, 박사, 부연구원, 연구 방향은 농산물 심도가공 및 기능성 식품 개발입니다.