1996 년 2 월 장안립 박사의 초청으로 우리 실 연구원 엄가신이 프랑스 파스퇴르 연구소에 광견 바이러스 항원 항체 검사 기술을 연구하여 장안리 박사가 기증한 많은 자료와 실험 자료를 가져왔다.
1996 년 3 월 장안립 박사가 다시 우리 병원에 전문적으로 왔다. 이후 10 여 년 동안 장안리 박사는 매년 중국을 방문했다. 그의 후임자인 부르시 박사도 여러 차례 중국에 와서, 우리 병원과 광견병 바이러스 분자 유행병학 및 관련 진단 시약 연구를 실시하여, 우리 병원이 세계보건기구의 기준에 부합하는 광견병 검사 센터를 설립하고, 박사 학생을 양성하며, 유럽 등 기관과 연구 프로젝트 경비를 신청하는 것을 도왔다.
이 글의 연구결과는 RFFIT 의 반복성, 특이성, 민감성이 MNT (마우스 중화 실험) 보다 낮지 않고 더 빠르고 저렴하며, RV 와 항체 수요가 많은 대부분의 경우 MNT 를 대체할 수 있다는 것을 다시 한 번 입증했다.
1998 10 장안리 박사와 Bourhy 박사가 발기해 조직한 PRA (중법고급연구계획) 가 지원하는 중법광견병 진단 및 통제학원이 중국 질병통제센터 전염병연구소 (경) 에서 성공적으로 개최됐다. 우리 병원의 엄가신 서그린이 이번 훈련에 참가했다.
본 연구실의 제품은 프랑스 파스퇴르 연구소 세계보건기구 광견병 참조 및 협력센터에 네 차례 보내진 결과 특이성과 민감성이 모두 외국의 동종 제품보다 우수하다. 우리나라의 몇 차례 전국적인 광견병 세미나와 강습반에서 우리가 세운 방법과 조제한 시약 () 가 호평을 받았고, 외국 시약 () 와 대량의 현장 비교 실험을 실시하여 효과가 같거나 더 좋다는 것을 증명하였으나 비용은 오히려 크게 낮아졌다. 수년 동안 프랑스 파스퇴르 연구소는 우리가 생산한 검사 테스트 키트 대량뿐만 아니라 관련 연구를 위해 우리의 단일 복제 항체 (원료) 도 구입했다.
본 실험실에서 준비한 광견병 바이러스 검사 시약 () 는 프랑스 튀니지 그리스 이란 등에 수출되어 광견병 실험실 진단을 위해 사용되었습니다. 사용자 피드백에 따르면, 우리 제품의 검출 감도는 외국의 유사 시약 보다 우수하다.
(이 작업은 프랑스 파스퇴르 연구소 세계보건기구 광견병 참조 및 협력 센터 주임인 HerryTsiang 박사가 기술 멘토를 진행하며 프랑스 파스퇴르 Merieult 혈청 백신 회사 (PMSV) 가 부분적으로 지원했다. ) 을 참조하십시오
국내에서 처음으로 항광견병 바이러스 (RV) 핵단백질 (NP) 형광 마크 항체 (NP) 를 준비한 결과 빠른 형광 초점 억제 실험 (RFFIT) 검사 RV 와 항체. 쥐중화 실험 (MNT) 에 비해 반복성, 특이성, 민감성은 크게 다르지 않다. 대부분의 경우 RV 및 항체 감지가 필요한 경우 MNT 를 대체할 수 있습니다.
광견병은 중국과 많은 개발도상국에서 여전히 심각한 문제 [1-3] 로 남아 있기 때문에 광견병 바이러스 (RV) 와 관련된 빠르고 실용적인 탐지 방법을 확립하고 보급할 필요가 있다. 세계보건기구 전문가위원회는 쥐 중화 실험 (MNT) 과 RFFIT 를 RV 중화 항체 테스트의 두 가지 기본 방법 [4] 으로 인정하고 추천하며 MNT 를 가능한 한 빨리, 더 저렴하고, 민감도가 MNT 와 비슷하기 때문에 가능한 한 RFFIT 로 대체할 것을 권장합니다. RFFIT 는 항 RV 핵 단백질 (NP) 형광 항체 필요 합니다. 국내에서 이 핵심 시약 [5] 의 성공적인 시험 제작을 바탕으로 micro-RFFIT 방법을 확립하여 이 방법의 반복성, 특이성 및 민감성을 MNT 와 비교했습니다. 이 방법은 광견병의 임상 진단, 백신 품질 관리 및 역학 조사 등에 광범위하게 적용될 것으로 예상된다. 관련 실험 결과는 다음과 같이 보고됩니다.
BHK2 1/BSR 세포, 이 세포주에 적합한 RV 공격 바이러스 CVS 균주 (ATCCVR959), 알려진 중화 역가 (IU/ml) 의 항RV 표준혈청 (로트 번호 I-/KLOC-0) RV 백신 접종 전후의 인혈청 (프랑스 파스퇴르 Merieult 혈청 백신 회사에서 생산한 VERORAB 또는 내가 생산한 RV 백신) 은 우리 실 쇼딩창 박사가 제공한다.
세포 배양기: D-MEM, 깁코 brl 제품. Lab-Tak 세포 배양 슬라이드, Nunc 제품. 팔콘 96 홀 플랫 바닥 세포 배양판. Opton 형광 현미경. RVNP 형광 마크 항체 참조 기준은 프랑스 파스퇴르 세노피 진단 제품 회사 제품 (로트 번호 6E022U) 으로, 간단히 pNF 라고 합니다. 본 실험실에서 제조한 해당 제품, 이 글은 mNF, 참고 문헌 [5] 이라고 합니다. 이 문서에 pNF 가 명시되어 있지 않은 곳에서는 mNF 를 사용합니다.
조직 배양에서 RV 의 빠른 적정은 문헌 [5-6] 에 따르면 RV 샘플이 시리즈 희석을 거쳐 BSR 세포에 감염되며, 24 시간 (고정 바이러스) 또는 48 시간 (거리 바이러스) 은 세포질에서 봉입체 (주로 RV 로 구성된 NP) 의 형광을 감지할 수 있다. 일반적으로 저배율 현미경 (160X) 에서 20 개의 시야 (Lab-Tak 슬라이드 사용 시) 또는 8 개의 시야 (96 홀 세포 배양판 사용 시) 를 검사합니다. Reed & amp；; 명희법으로 계산하면 형광 초점 단위 (FFU/ 밀리리터) 로 표시됩니다. RFFIT 과정에서 CVS 균주를 사용하여 바이러스를 공격한다. 바이러스의 최적 공격량은 부화 24 시간 후 세포의 80% 에 감염될 수 있는 최대 희석도 (형광봉입체 생성) 이다.
고정량의 CVS 바이러스와 일련의 희석된 측정 대상 혈청 (알려진 역가의 참고혈청 포함) 을 부화 (체외 중화 반응) 한 다음 민감한 세포 (BSR) 현액을 첨가한다. 부화 24 시간 후 아세톤으로 세포 단층을 고정시키고 형광 항NP 항체 염색으로 미중화 바이러스의 존재 (형광 초점) 를 탐지한다. 바이러스 대조군에 비해 테스트될 각 혈청의 FFU/ml 고정량 CVS 바이러스의 희석도를 50% 줄인 다음 알려진 효능의 참고혈청과 비교해서 테스트될 각 혈청의 중화 항체 효능가를 계산한다.
같은 CVS 바이러스를 나누어 70 C 를 보존하고 반년 동안 mNF 와 pNF 로 6 차례 효능을 측정했다. 결과는 상당히 안정적이며 그 사이에는 차이가 없다 (바이러스 희석도 1 103.5, t=0.445, P 0.05; 바이러스 희석 1 104.2 의 경우
T=0.353, P0.05, 표 1 참조. 이 CVS 그루의 쥐체내 독성 역가는 5.5 logd 50/ml(Sm = 0.4 logd 50/ml) 로 측정되며, 독력 참조 기준으로 알 수 없는 샘플의 쥐내 독성 역가를 환산할 수 있다. (마우스 LD50 역가는 알 수 없는 RV 샘플의 역가와 조직 배양에서 이 참조 샘플의 역가의 비율에 따라 직접 환산할 수 있다. CVS 독력은 24 시간 부화를 통해 BSR 세포의 80% 를 감염시킬 수 있으며, 최대 희석도는 1 160 으로 RFFIT 의 최적의 바이러스 공격 복용량으로 꼽힌다.
프랑스 파스퇴르 연구소에서 제공하는 항RV 표준혈청을 참고로 RFFIT 와 MNT 로 각각 참조 혈청 A 와 B 의 중화역가를 4 회 측정한 결과 표 2 에 나와 있다. 두 방법 사이에는 큰 차이가 없습니다 (샘플 A, t=0 어린이 면화). 444, P0.05 샘플 b 의 경우 t=0 입니다. 768, P0.05), 두 가지 방법으로 얻은 결과가 기본적으로 일치한다고 생각할 수 있습니다.
RFFIT (mNF 와 pNF 병행 사용) 와 MNT (샘플과 효능이 0.5IU/ml 보다 큰지 여부만 확인) 로 52 인의 혈청 샘플 접종 전후의 RV 중화 효능을 측정한다. RFFIT 측정에서 mNF 와 pNF 가 얻은 형광 항체 역가의 일치율 (52/52) 은 100% 이고 RFFIT 와 MNT 의 일치율 (5 1/52) 은100% 였다 일치하지 않는 샘플은 음성으로 확인되어 RFFIT 재테스트를 통해 임계값 (0.5 IU) 보다 약간 높은 역가를 보였다. 이것은 또한 RFFIT 의 감도가 MNT 보다 약간 높을 수 있음을 보여준다.
VERORAB 백신 (37 번과 45 번) 과 내가 생산한 RV 백신 (12 1 호) 을 접종한 사람들이 서로 다른 시간에 채집한 18 개의 혈청 표본의 RV 와 항체 역가를 동시에 검출했다 그 결과, RFFIT 와 MNT 는 같은 혈청의 효능이 거의 일치하는 것으로 나타났다. 대부분의 결과는 해당 산술 평균에 비해 동일합니다.
본 실험실에서 준비한 mNF 는 원가가 낮고 효과가 안정적이다. 상술한 응용실험에서 특이성과 민감성은 프랑스 파스퇴르 세노피 진단제품회사의 해당 제품 pNF 와 똑같다. 이 두 시약 모두 프랑스 파스퇴르 연구소 세계보건기구 광견병 참고와 협력센터의 비교 실험에서도 같은 결과를 얻었다 (H.Tsiang, personal communication).
항NP 형광 표시 항체 적용에 기반한 RFFIT 방법의 원리와 결과는 MNT 와 매우 일치하며 (모두 특이성 감지 항RV 보호 및 항체), MNT 보다 더 빠릅니다 (실험 시간이 14 일에서 2 근무일로 감소). 저렴하고 반복성이 뛰어나 세계보건기구의 긍정과 추천을 받았습니다.
Fitzgerald 등 [8] MNT 와 RFFIT 의 반복성을 비교하기 위해 3 개 실험실에서 공동 연구를 실시했습니다. 같은 샘플이 같은 실험실에서 검출된 경우 MNT 의 변이 범위는 67%- 149%, RFFIT 의 변이 범위는 68%- 146% 였다. 이 글은 RFFIT 와 MNT 를 각각 참고혈청 A 와 B 의 중화역가를 4 번 측정했다. 샘플 a 와 b 에 대한 MNT 의 변형 범위는 각각 8 1%- 123% 와 78%- 129%, 샘플 a 와 b 에 대한 RFFIT 의 변형 범위는 각각 83 입니다 그 결과, RFFIT 의 반복성은 MNT 보다 낮지 않으며, 두 가지 방법 모두 검사 결과에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
Zalan 등 [9] RFFIT 방법을 소형화하여 값비싼 Lab-Tak 세포 대신 96 공세포 배양판을 이용해 슬라이드를 배양한다. 그 장점은 대량의 샘플을 동시에 처리할 수 있어 시약 사용량을 크게 줄이고, 결과를 관찰하기 쉽고, 판단 오차를 줄일 수 있다는 것이다. 이 글의 연구결과도 이런 소형화 방법이 더 유리하고 보급할 가치가 있다는 것을 증명했다.
요약하자면, 이 글의 결과는 RFFIT 의 반복성, 특이성, 민감성이 MNT 보다 낮지 않고 더 빠르고, 저렴하며, 더 간단한 장점을 가지고 있다는 것을 다시 한 번 증명한다. RV 와 항체 검사가 필요한 대부분의 경우 RFFIT 는 MNT 를 대체할 수 있으며 우리나라 광견병 예방과 연구에 광범위하게 적용될 것으로 예상된다.
5. 엄가신, 이성평, 서그린 등. 항 광견병 바이러스 핵 단백질 형광 표지 항체 준비 및 예비 응용, 제 4 회 전국 생물 제품 회의 논문집, 우한, 1997, P 1 10.
8. 피츠제럴드, 카바소프, 스미스 등. 혈액중화실험 (MNT) 과 초고효율 형광집중 억제 실험 (RFFIT) 을 통한 실험동물 면역글로불린 (사람) 에 대한 실험실 연구. 생물역,1979,7 (1): 67.
형광소 마크를 기반으로 한 항체 저장가능 바이러스 (RV) 핵단백질 (NP) 의 제비, 정량 연구 및 항체 (RFFIT) 를 위한 형광 초점 억제 실험 (RFFIT) 을 설정하고 반복, 특이성 및 민감성을 중화 실험 (MNT) 과 비교했습니다.
성명: 이 글은 저자의 밝은 오리지널 칼럼이다. Com 건강 채널. 그 오리지널성과 글에서 설명한 글과 내용은 모두 본 그물에 의해 확인되지 않았다. 본 사이트는 본 문서 및 콘텐츠 및 텍스트의 전부 또는 일부에 대한 신뢰성, 무결성 및 적시성에 대해 어떠한 보증이나 약속도 하지 않습니다. 참고, 정보 제공만을 목적으로 하며, 관련 내용을 스스로 확인하세요. 출처 광명망 건강 채널)