1 시동자의 선택과 전환은 종종 이상적인 유전자 변형 식물을 얻지 못하는 중요한 원인이다. 프로모터는 유전자 표현을 결정하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 가장 먼저 고려해야 할 것은 적절한 식물 프로모터를 선택하고 그 활성화를 높이는 것이다. 현재, 식물 표현 전달체에서 광범위하게 사용되는 시동자는 구성형 시동자이다. 예를 들어, 대부분의 쌍자엽 형질 전환 식물은 C a M V 3 5 S 프로모터를 사용하는 반면, 단엽 형질 전환 식물은 주로 옥수수의 U b I q u I t I n 프로모터와 벼의 A c t I n l 프로모터를 사용합니다. 이러한 구성형 표현 시동자의 통제하에 외원 유전자는 유전자 변형 식물의 모든 부분과 모든 발육 단계에서 표현될 것이다. 하지만 수용체 식물에서 외원 유전자의 지속적이고 효율적인 표현은 낭비를 초래할 뿐만 아니라 식물의 형태 변화를 일으켜 식물의 성장과 발육에 영향을 미치는 경우가 많다. 외원 유전자가 식물에서 효과적인 역할을 하고 식물에 미치는 악영향을 줄이기 위해, 특이표현 프로모터의 연구와 응용에 점점 더 많은 관심을 기울이고 있다. 발견된 이성 시동자는 주로 장기 이성 시동자와 유도 이성 시동자를 포함한다. 예를 들어 종자 특이성 프로모터, 열매 특이성 프로모터, 엽육세포 특이성 프로모터, 루트 이성 프로모터, 상해 유도 프로모터, 화학 유도 프로모터, 광 유도 프로모터, 열유도 프로모터 등이 있다. 이러한 특이한 시동자의 복제와 응용은 식물에서의 외원 유전자의 특이적 표현의 기초를 다졌다. 예를 들어, 스위스 CBA-Geigey 는 P R-I A 프로모터를 사용하여 유전자 변형 담배에서 B t 독소 유전자의 표현을 통제한다. 프로모터는 살리실산과 그 유도물에 의해 유도될 수 있기 때문에 해충이 재발하는 계절에 저렴하고 오염되지 않은 화학물질을 뿌려 항충유전자의 표현을 유도하는 것은 매우 효과적인 방법이다. 식물 유전자 변형 연구에서 천연 시동기를 사용하면 만족스러운 결과를 얻지 못하는 경우가 많다. 특히 특이성 표현과 유도표현을 할 때 표현 수준이 대부분 좋지 않다. 기존 프로모터를 개조하면 복합 프로모터를 구축하는 것이 매우 중요한 방법이 될 것이다. 예를 들어, N I 등은 문어알칼리 합성효소 유전자 프로모터의 전사 활성화 영역을 단로알칼리 합성효소 유전자 프로모터와 결합한 결과, G U S 표현 결과 손질된 프로모터 활성성이 3 5 S 프로모터보다 현저히 높다는 것을 알 수 있다. 오서 등은 PI-III 유전자의 유도형 시동자를 벼 A C T I N 유전자의 인트론 1 과 결합시켜 새로운 시동자의 표현 활성화를 거의 1 0 배 (특허) 높였다. 이 인공 시동자들은 식물 유전자 공학 연구에서 중요한 역할을 했다. 2. 번역 효율 향상 외원 유전자의 번역 효율을 높이기 위해, 전달체를 만들 때 일반적으로 유전자를 손질하며, 주로 2. 1 5'-3'- 비번역 서열을 추가하는 세 가지 측면을 고려한다. 많은 실험에서 진핵 유전자의 5'-3'- 비번역 서열 (U T R) 은 유전자의 정상적인 표현에 매우 필요하며, 이 단편의 누락은 종종 담배 꽃잎바이러스 (T M V) 의 1 2 6 k D a 단백질 유전자와 같은 m R N A 의 안정성과 번역 수준을 초래한다는 것을 발견했다. 현재, 많은 벡터들이 외원 유전자의 5' 끝에 번역 향상 시퀀스를 추가했다. I n g e l b r e c h t 등은 각종 유전자의 3' 단서열을 연구한 결과 문어알칼리 합성효소 유전자의 3' 단서열이 N P T I 유전자의 순간적인 표현을 2 0 배 이상 높일 수 있다는 것을 발견했다. 게다가, 유전자마다 3'- 말단 서열은 유전자 표현 촉진에 있어서 서로 다른 효율을 가지고 있다. 예를 들어, RBCs 의 3'- 말단 서열은 찰케톤합효소 유전자보다 6 배 높은 유전자 표현을 촉진한다. 2.2 최적화 시작 코돈 주위의 서열은 시작 코돈이 생물학적으로 보편적이지만, 서로 다른 생물원의 유전자는 시작 코돈 주위에 특별한 서열을 가지고 있다. 예를 들어 식물 시작 코돈 주변 서열의 전형적인 특징은 A A C C A U G C 이고, 동물 시작 코돈 주변 서열은 C A C A U G 로 원핵 생물과는 매우 다르다. K o z a k 는 시작 코돈 A T G 주변 염기의 부위 지정 돌연변이가 전사와 번역에 미치는 영향을 상세히 연구하고, 진핵생물에서는 시작 코돈 주변 시퀀스가 C C A T G G 때 변환과 번역 효율이 가장 높다는 결론을 내렸다. 특히 A at-3 위치는 번역 효율성에 매우 중요하다. 이 시퀀스는 나중에 k0z a K 시퀀스라고 불리며, 전달체의 구성을 표현하는 데 사용된다. 예를 들어, 원래의 초기 암호 서열이 U U U U A U G G 세균 키틴효소 유전자가 있는데, 그것이 A C C A U G G 수정되었을 때 담배의 표현 수준이 8 배 높아졌다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 담배명언) 따라서 비식물 유전자로 표현 벡터를 만들 때는 식물 시작 코돈 주변 서열의 특징에 따라 개조해야 한다. 2.3 유전자 코딩 영역의 손질 외원 유전자가 원핵 생물에서 나온 경우 표현 메커니즘의 차이로 인해 식물에서의 표현수준이 낮은 경우가 많다. 예를 들어, 소운금나물균에서 온 야생형 살충단백질 유전자는 식물에서의 표현 수준이 매우 낮았다. 원핵 생물과 식물 유전자의 차이로 인해 m R N A 의 안정성이 떨어지는 것으로 밝혀졌다. 독단백질 아미노산 서열을 바꾸지 않고 미국 M o n s a n t o 사의 P e r l a k 등이 살충단백질 유전자를 개조해 식물이 선호하는 코돈 (codon) 을 선택해 G C 의 함량을 증가시켰다. 그 결과 유전자 변형 식물에서 독단백질의 표현량이 30 ~ 100 배 증가하여 뚜렷한 항충 효과를 얻었다. 3 위치 효과 제거 외원 유전자가 수용체 식물로 옮겨지면 유전자 변형 식물에 따라 표현 수준이 크게 달라지는 경우가 많다. 이는 주로 수용체 식물 게놈에 있는 외원 유전자의 삽입 지점이 다르기 때문이다. 이것은 소위 "위치 효과" 입니다. 위치 효과를 없애기 위해 모든 외원 유전자를 식물 게놈의 전사 활성 영역으로 통합하는데, 현재 표현 전달체 구축 전략에서는 일반적으로 핵기질 결합 영역과 정점 통합 기술을 적용하는 것을 고려하고 있다. M A T R I X A S O C I A T I O N R E G I O N (M A R) 은 진핵 세포의 염색질에 존재하는 D N A 시퀀스로 핵 매트릭스 특이성과 결합된다. 일반적으로 M A R 의 서열은 활동적인 D N A 의 고리 모양의 경계에 있는 것으로 여겨지며, 이는 분열을 일으켜 각 전사 단위를 상대적으로 독립적으로 유지하고 주변 염색질의 영향을 받지 않도록 하는 역할을 한다. 관련 연구에 따르면 M A R 을 목적유전자의 양쪽에 놓고 M A R-g e n e-M A R 구조가 포함된 식물 표현 전달체를 구축해 유전자 변형을 하는 것으로 나타났다. 목적유전자의 표현 수준을 크게 높이고 유전자 변형 식물 간 목적유전자 표현 수준의 차이를 줄여 위치 효과를 낮출 수 있다. 예를 들어, l l e n 등은 이원 M A R (효모에서) 과 동원 M A R (담배에서) 이 담배에서 G u s 유전자의 표현에 미치는 영향을 연구한 결과, 효모의 M A R 은 유전자 변형 표현 수준을 평균 65438 0.2 배 높일 수 있는 반면, 담배 자체의 M A R 은 유전자 변형 표현 수준을 평균 6 배 높일 수 있는 것으로 나타났다. 닭 리소자임 유전자의 M A R 을 이용하는 것도 같은 역할을 할 수 있다. 또 다른 실행 가능한 방법은 사이트 지향 통합 기술을 채택하는 것입니다. 이 기술의 주요 원리는 변환 벡터에 숙주 염색체와 동족인 D N A 조각이 포함되어 있을 때 외원 유전자가 동원을 통해 염색체의 특정 부위로 통합될 수 있다는 것이다. 실제로 먼저 염색체 전사 활성 영역의 D N A 조각을 분리한 다음 식물 표현 전달체를 구축해야 한다. 미생물의 유전자 조작에서 동원재편성점 통합은 이미 통상적인 기술이 되었으며, 외원 유전자의 점 통합은 동물에서 이미 성공을 거두었지만 식물에서는 엽록체 표현 전달체를 제외하고는 핵변환 성공 보도가 거의 없다. (존 F. 케네디, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 동물명언) 4 엽록체 표현 전달체의 구축은 핵 변환에서 핵 유전자가 꽃가루의 확산으로 인한 표현 효율성 저하, 위치 효과, 불안 등의 문제를 극복하기 위해 최근 몇 년 동안 출현한 새로운 유전변환 기술인 엽록체 변환이 우세와 발전 전망으로 인정받고 중시되고 있다. 지금까지 담배, 벼, 의남, 감자, 유채 5 개 식물에서 엽록체 전환 (후병카이 등 발표) 이 이뤄져 이 변환 기술이 식물 유전공학의 새로운 성장점이 됐다. 현재, 많은 식물 엽록체 게놈의 전체 서열이 확인되어, 이는 동원구조 조정 메커니즘을 통해 외원 유전자 포인트를 엽록체 게놈에 통합하기 위한 토대를 마련했다. 현재 구축되어 있는 엽록체 표현 전달체는 기본적으로 고정 점 통합 전달체이다. 구축된 엽록체 표현 전달체는 기본적으로 지정 사례 전달체에 속한다. 엽록체 표현 벡터를 만들 때, 엽록체의 D N A 서열은 일반적으로 소스 유전자 표현 상자의 양쪽에 연결되어 있으며, 이를 동원재조합 조각 또는 위치 조각 (T a r g e t I n g f r a g m e n t) 이라고 합니다. 벡터가 엽록체에 도입될 때, 이 두 조각이 엽록체 게놈의 같은 조각과 함께 재조합하면, 외원 유전자를 엽록체 게놈의 특정 부위에 통합할 수 있다. 작물 개량을 위한 엽록체 변환에서 동원재구성이 필요한 후 외원 유전자의 삽입으로 엽록체 유전자의 원래 서열이 손실되거나 원래 유전자가 삽입 지점에서 기능을 손상시키지 않는다. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 r b c L/a c c D, 1 6S TR NV/R PS L 2R PS 7, PB BA/T R NK, RP S 7/N D HB 와 같은 두 개의 인접한 유전자를 동원재조합 조각으로 선택했습니다. 동원이 재편성될 때 외원유전자점은 인접한 두 유전자의 간격에 삽입되어 원유전자의 기능이 영향을 받지 않도록 한다. 최근 D 'ANIEL 등은 담배 엽록체 유전자 t r n A 와 t r n I 를 동원재조합 단편으로 이용해 u NIV e r s a l v e c t o r (u NIV e r s a l v e c t o r) 을 구축했다. T r n A 와 t r n I 의 D N A 서열이 고등 식물에서 매우 보수적이기 때문에 저자는 이 전달체가 여러 식물의 엽록체 전환에 사용될 수 있다고 생각한다. 만약 이 전달체의 공통성이 증명된다면, 이 작업은 의심할 여지 없이 편리하고 실용적인 신형 엽록체 표현 전달체를 구축하는 데 좋은 아이디어를 제공할 것이다. 엽록체 게놈의 높은 복사본으로 인해 엽록체 게놈에 통합된 외원 유전자는 종종 효율적으로 표현된다. 예를 들어, 처음으로 M C B R Y I A (c) 독소 유전자를 담배 엽록체로 옮겼고, B t 독소 단백질의 표현량은 잎총 단백질의 3 ~ 5% 에 달하며, 통상적인 핵변환 기술은 0.00 1% ~ 0.6% 에 달할 수밖에 없다. 최근 K o t a 등은 Bt CrY2A2 단백질의 유전자를 담배 엽록체로 옮긴 결과, 독소단백질이 담배 잎에 많이 표현되어 수용성 단백질의 2 ~ 3% 를 차지하며 핵전환보다 20 ~ 30 배 높은 것으로 나타났다. 유전자 변형 담배는 민감한 곤충에 저항할 수 있을 뿐만 아니라 내성이 높은 곤충도 죽일 수 있다. 최근 STA AUB 등은 사람의 성장호르몬 유전자가 잎에서 총 단백질의 7% 에 달하며 핵전환보다 3 0 0 배나 높다고 보도했다. 이 실험들은 엽록체 표현 전달체의 건설과 전환이 외원 유전자의 효율적인 표현을 실현하는 중요한 방법 중 하나라는 것을 충분히 보여준다. 5 위치 지정 신호의 응용 위에서 언급한 전달체 최적화 전략의 주요 목적은 외원 유전자의 전사와 번역 효율을 높이는 것이다. 하지만 높은 수준의 외원 단백질이 식물 세포에 안정적으로 존재할 수 있는지, 얼마나 축적될 수 있는지는 식물 유전자 전환에 고려해야 할 또 다른 중요한 문제이다. 최근 연구에 따르면 일부 외원 유전자를 적절한 위치 신호 시퀀스와 연결하여 엽록체, 내질망, 액포 등과 같은 세포의 특정 부위로 운반할 경우 외원 단백질의 안정성과 축적을 크게 높일 수 있는 것으로 나타났다. 이는 내질망 등 일부 지역이 일부 외원단백질에 비교적 안정적인 내환경을 제공하여 외원단백질의 분해를 효과적으로 막았기 때문이다. W o n g 등과 같이 의남 의남 의남 r b c S 아기의 운송단백질 서열을 살충단백질 유전자에 연결한 결과, 살충단백질이 유전자 변형 담배 엽록체에 특이하게 축적될 수 있으며, 외원단백질의 총 누적량은 대조군보다 10 ~ 20 배 높은 것으로 나타났다. 요즘, 송, 등. 또한 r b c S 아기의 전달펩티드 서열을 P H B 합성과 관련된 유전자와 연결시켜 유전자 발현 산물을 유전자 변형 유채 씨앗의 질체에 축적시켜 외원 단백질 함량을 늘리려 한다. 또한 W a n d e l t 등과 S c h o u t e n 등은 내질망의 위치지정 시퀀스 (4 펩티드 K D E L 의 코드화 시퀀스) 를 외원단백질 유전자와 연결시켜 유전자 변형 식물의 중외원 단백질 함량이 현저히 높아진 것으로 나타났다. 위치 신호는 단백질 축적을 촉진하는 데 긍정적인 역할을 하지만, 동일한 위치 신호가 모든 단백질에 적용되는지 여부는 더 확정해야 한다. 6 인트론은 증강유전자 표현에 인트론을 적용해 유전자 발현을 증강시키는 역할을 Callis 등이 먼저 유전자 변형 옥수수에서 발견한 것으로, 옥수수 알코올 탈수효소 유전자 (A d h l) 의 첫 번째 인트론 (I n t r o n 1) 은 대외적 유전자 발현에 뚜렷한 증강작용을 하는데, 이 유전자의 다른 인트론 (예: I N T R O) 이 있다. 나중에 V a s I l 등은 옥수수에 있는 과당 효소 유전자의 첫 번째 인트론이 C A T 의 표현 수준을 1 0 배로 높일 수 있다는 사실을 발견했다. 벼근동단백질 유전자의 세 번째 인함자도 보고 유전자의 표현 수준을 2 ~ 6 배 높일 수 있다. 지금까지, 인트론이 유전자 표현을 강화하는 메커니즘은 아직 명확하지 않지만, 인트론의 존재가 m R N A 의 가공효율과 안정성을 향상시킬 수 있다고 일반적으로 믿고 있으며, Tannaka 등의 많은 연구에 따르면 인트론 증강 유전자 표현은 주로 단엽식물에서 발생하지만 쌍자엽식물에는 발생하지 않는 것으로 나타났다. 인트론은 유전자 표현을 향상시킬 수 있기 때문에, M c e l r o y 등은 단자엽식물 표현 벡터를 만들 때 벼근동단백질 유전자의 첫 번째 인트론을 유전자 시동자의 하류에 특별히 남겨 두었다. 마찬가지로, C h r I s t e n s e n 등은 옥수수 U b I q u I t I n 유전자의 첫 번째 인트론을 프로모터 하류에 배치하여 단엽 식물에서 외인성 유전자의 표현을 높인다. 그러나 특정 인트론이 유전자 표현에 미치는 촉진 작용은 프로모터 강도, 세포 유형, 과녁 유전자 서열 등 다양한 요인에 달려 있으며, 때로는 인트론이 운반체에서의 위치에 따라 달라지는 경우도 있다는 연구결과도 있다. 예를 들어, 옥수수 ADDHL 유전자의 인트론 9 는 G u s 유전자의 5' 끝에 있으며, CAMV V35S 프로모터의 통제하에 G u s 유전자의 표현이 향상되지 않았다. 인트론이 G u s 유전자의 3- 끝에 있을 때, 같은 시동자의 통제하에 G u s 유전자의 표현량이 약 3 배 증가했다. 인트론이 유전자 표현에 작용하는 메커니즘은 복잡할 수 있으며, 인트론을 이용하여 효율적인 식물 표현 벡터를 만드는 방법도 고정적인 패턴이 부족하다는 것을 알 수 있어 더 연구할 만하다. 7 여 유전자 전략 지금까지 대부분의 유전자 변형 연구는 단일 외원 유전자를 수용체 식물로 옮기는 것이다. 그러나 때로는 단일 유전자 발현 강도 또는 단일 작용 메커니즘이 부족하여 이상적인 유전자 변형 식물을 얻을 수 없는 경우도 있다. 둘 이상의 협동유전자를 동시에 식물로 옮기면 단일 유전자 전환보다 더 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이 전략은 이미 병충해에 저항하는 유전자 변형 식물을 재배하는 데 적용되었다. 예를 들어, 항충 유전자의 항충 스펙트럼과 작용 메커니즘에 따라, 두 가지 기능을 보완하는 유전자를 선택하여 전달체 건설을 하고, 일정한 방식으로 두 가지 항충 유전자를 동시에 식물로 옮길 수 있다. 왕위 등은 렉틴 유전자와 단백질효소 억제제 유전자를 동시에 면화로 옮겨 2 가 항충 유전자를 함유한 형질 전환 식물을 얻었다. B a r t o n 등은 B t 살충단백질 유전자와 전갈독소 유전자를 동시에 담배로 옮기는 등 항충성과 해충의 항성 방지 능력 (특허) 을 크게 높였다. 내병성 방면에서 우리 연구실의 블루해연 등은 베타-1,3- 글루칸효소 유전자와 키틴효소 유전자를 함유한 쌍가 식물 표현 벡터를 구축해 유채와 면화에 도입했다. 결과는 형질 전환 식물이 명백한 질병 저항성을 가지고 있음을 보여줍니다. 최근 풍도영, 이보건 등은 2 ~ 3 개의 항진균유전자와 h p t 유전자를 한 벡터에 연결하고, 두 개의 항충유전자와 b a r 유전자를 다른 벡터에 연결하고, 유전자총으로 벼식물에 도입했다. 그 결과 야생 벼 후손 식물의 7 0% 는 모두 도입된 외원 유전자 (6 ~ 7 개) 를 포함하고 있으며, 도입된 외원 유전자는 게놈의 한 개 또는 두 개의 부위에 통합되는 경향이 있는 것으로 나타났다. 일반적으로 일반 변환에서는 2 5 k b 보다 큰 외원 D N A 조각을 식물 세포로 가져올 수 없습니다. 식물의 양적 특성 유전자, 항병 유전자 등과 같은 일부 기능 관련 유전자는 대부분' 유전자 클러스터' 형태로 존재한다. 1 0 0 k b 보다 큰 D N A 의 큰 조각을 식물 염색체에 자연적으로 존재하는 유전자 클러스터나 일련의 관련이 없는 외원 유전자를 식물 게놈의 같은 부위에 도입한다면, 여러 유전자에 의해 제어되는 우수한 특성이나 광범위한 스펙트럼의 항충과 항병을 가질 수 있습니다. 수용체 세포에 새로운 대사 경로를 부여하여 새로운 생체 분자를 생산할 수도 있습니다. 또한 큰 게놈이나 유전자 클러스터의 동시 삽입도 유전자 조작으로 인한 위치 효과를 어느 정도 극복하고 유전자 침묵 등 좋지 않은 현상의 발생을 줄일 수 있다. 최근 미국의 H a m I l t o n 과 중국의 류요광은 차세대 전달체 시스템인 B I B A C 와 T A C 를 개발했다. 이들은 D N A 의 큰 단편을 복제하고 농균을 이용해 식물을 직접 전환했다. 이 두 가지 벡터는 유전자의 비트맵 복제를 가속화할 수 있을 뿐만 아니라 다중 유전자 통제하에 있는 품종 개량에 잠재적인 응용가치를 가지고 있다. 현재, B I B A C 와 T A C 벡터는 다중 유전자 변환에서의 응용 연구가 이제 막 시작되었다. 8 스크리닝 마커 유전자의 사용과 누락 된 스크리닝 마커 유전자는 유전자 변형에서 형질 전환 세포 (또는 개인) 가 많은 수의 비 형질 전환 세포에서 스크리닝 될 수있는 마커 유전자를 말한다. 이들은 일반적으로 유전자 변형 세포가 어떤 선택제에 내성이 있는 산물을 만들어 유전자 변형 세포가 이런 선택제가 첨가된 배양기에서 정상적으로 자라게 하는데, 유전자 변형 세포가 항성 부족으로 인해 이런 선택제에 민감하게 반응하여 성장, 발육, 분화를 할 수 없다. 벡터를 만들 때, 선별 표시 유전자는 목적 유전자의 한쪽에 연결되며, 각 유전자에는 자체 유전자 조절 시퀀스 (예: 시동자, 종결자 등) 가 있다. ). 현재 일반적으로 사용되는 선별 마커 유전자는 항생제 항성효소 유전자와 제초제 항성효소 유전자의 두 가지 주요 범주로 나뉜다. 전자는 특정 항생제에 내성을 가질 수 있고, 후자는 제초제에 내성을 가질 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 항생제 항성효소 유전자는 N P T I I I 유전자 (신마이신 인산 전이효소, 항카나마이신), H P T 유전자 (조마이신 인산 전이효소, 항조마이신), G e n t T 유전자 (항겐다마이신) 입니다. 일반적으로 사용되는 제초제 내성 유전자는 ESP 유전자 (5- 에놀 아세톤산 무모초산 -3- 인산합효소, 항초단산), G O X 유전자 (초단산화효소 생성, 초단산 분해), b a r 유전자 (PPP 아세틸 전이효소 생성, 항 B A L A P H O S 또는 G L U F 위의 1, 2,3,5,6 은 모두 주목할 만하다. 특히 5 는 세포 밖으로 분비하고 싶기 때문이다. 골격 벡터는 B I 말라리아 원충 1 2 1 이 될 수 있으며, 그 위에서 유전자형을 바꿀 수 있습니다. 다음은 복제 단계입니다. 비교적 간단합니다. 1 먼저 목적유전자의 효소를 얻어서 개조된 벡터에 연결한다. 2. 플라스미드를 대장균 D5A 로 옮겨 증폭시키는 데 3 을 사용한다. 증폭된 플라스미드를 식물 세포로 옮겨 4 를 표현한다. 뿌리 세포 외 배양기를 수집하여 단백질이 표현되고 분비되는지 검출하다. 운반체를 개조하는 단계에 관해서는 질문에 대답하면 간단히 말해 보세요. 결국, 만약 당신이 정말로 운반체를 만들었다면, 당신은 스스로 회사를 개설할 수 있습니다. 간단한 단계를 말씀드리겠습니다: 1 적절한 효소 절단 부위를 선택하겠습니다. 주로 당신이 사용하는 전달체의 다중 복제 부위를 참고하며, 일반적으로 이중 효소를 사용하는 것이 좋습니다. 방향 검증 문제는 없습니다. 선택한 제한 부위에 따라 프라이머 복제 유전자를 설계합니다. 3. 벡터와 유전자의 P-C-R 산물은 각각 효소로 소화한 후 회수한다. 젤라틴 회수를 선택할 수도 있고, 무수에탄올로 침전할 수도 있습니다. 4 연결 효소 연결 5 전환 6 플라스미드 검증. P C R 검증 및 효소 소화 검증을 수행해야 한다. 7 정렬