QPCR 프라이머 디자인+온라인 검증
방법 1: NCBI 프로브
1. NCBI 이전에는 직접 프라이머를 설계하는 프로브 옵션이 있어 업스트림 및 다운스트림 시퀀스를 제공합니다. 예를 들어, 쥐 Nanog 유전자를 검색하면 다음과 같은 두 가지 유인물을 얻을 수 있습니다.
업스트림 유인물: TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT
하류 유인물: ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
방법 2: 프리미어 3 웹
참고: 프리미어 3 웹 온라인 프라이머 디자인-2 분 만에 미니멀리스트 프라이머 디자인 배우기! -빌리 빌리
2. 1. 유전자 서열 찾기
인간 p53 을 예로 들어 유인물을 설계하다.
PubMed 홈페이지:
첫 번째 단계: 풀다운 옵션은 뉴클레오티드를 선택합니다.
2 단계: 입력 유전자+종 +mRNA (예: p53humanmRNA).
세 번째 단계: 검색을 클릭하십시오.
4 단계: 을 클릭하고 왼쪽 열에서 (mRNA4.782) 을 선택합니다.
5 단계: 우리가 찾고 있는 p53humanmRNA 의 첫 번째 문장 (Homosapiens _ mRNA _ for _ p53, 전체 CDs) 를 클릭하세요.
6 단계: 선택 기능에서 CDS 옵션을 클릭합니다.
7 단계: FASTA 형식을 클릭하여 선택하면 이 유전자의 CDS 시리즈가 나타납니다.
2.2 프라이머 디자인을 시작하십시오.
프리미어 3 웹 홈페이지:
/
Primer3 웹 홈페이지를 입력한 후 다음을 수행합니다.
첫 번째 단계: 드롭다운 항목에서 종 (인간) 을 선택합니다.
2 단계: 입력 상자에 방금 복사한 CDS 시퀀스를 입력합니다.
세 번째 단계: 프라이머를 선택하려면 클릭하십시오.
4 단계, 출력 프라이머 시퀀스; 최종 결과 선택할 수있는 4 쌍의 프라이머가 있습니다.
적절한 프라이머 선택: 어떻게 적합합니까?
우선 유인물의 증폭 길이를 봐야지 100~300bp 사이에 증폭하는 것이 좋다.
유인물의 길이는 20~25bp 이며, 상류 하류 유인물의 차이는 5bp 를 초과해서는 안 된다.
그런 다음 Tm 값, 약 60 C 를 보면 차이가1℃를 초과하지 않아야 합니다.
한 가지 더 덧붙입니다.
QPCR 프라이머가 설계되었으므로 게놈 DNA 가 CT 값에 미치는 영향을 피하기 위해 엑손 디자인을 통과해야 합니다. 현상자를 가로지르지 않으면 용해 곡선을 확대하는 CT 값이 더 작아집니다. 그렇다면 자신이 디자인한 프라이머가 외현자를 넘어 설계되었는지 어떻게 알 수 있을까요?
대답은 우리가 설계 한 프라이머의 게놈 위치를 NCBI 의 엑손 및 인트론의 연결 위치와 비교할 수 있다는 것입니다. 그 유전자의 mRNA 연결 위치를 직접 보면 됩니다.
방법 3:NCBI- 폭발-프라이머-폭발
상기 유인물 설계가 완료된 후 인포메이터가 인트론을 넘어갔는지 수동으로 찾는 것은 너무 번거롭다. 그리고 더 편리한 방법을 보급한다.
참조:
3. 1: NCBI 에서 대상 유전자의 mRNA 서열을 찾습니다.
NCBI 메인 페이지를 열고, 유전자를 선택하고, 유전자 이름을 입력하세요.-"여러 가지 다른 이름을 가진 유전자를 보여줍니다.-"원하는 종을 찾고, 열어보세요.-"유전자 정보를 표시하고," mRNAandprotein "앞에 있는 NM
참고: 이 시점에서 NM**** * * 의 많은 정보를 볼 수 있습니다. 이 유전자의 다른 동료 유형을 설명하는 정보는 문헌과 이러한 유전자 서열 뒤에 있는 설명을 참고하여 확인할 수 있습니다. 잘 모르겠다면 보통 가장 긴 것을 고르세요.
엑손 전체에 프라이머 디자인을 시작하십시오.
NCBI 에서 -BLAST-primer-blast 웹 사이트를 열고 위에서 복사한 mRNA 번호를 시퀀스 상자에 입력하고 드롭다운 옵션에서 종을 선택한 다음 Exonjunctionspan 드롭다운 상자에서 primerusspananexon-exon jun 을 선택합니다 Primer-blast 결과 페이지로 이동할 수 있습니다. 이 과정은 좀 길어질 겁니다. 조금만 기다리세요. 나올 때 Graphicalviewofprimerpairs 라는 열이 있는데, 디자인 프라이머가 어떤 외현자를 통과했는지 알려 줍니다.
현자를 가로지르는 프라이머 쌍 중에서 가장 좋은 쌍을 선택하세요.
A) 한 쌍의 프라이머 중 단 하나의 프라이머만 엑손 을 통과한다. (프라이머가 인트론을 통과하기 때문에이 프라이머는 게놈 DNA 와 일치하지 않습니다. 다른 프라이머가 게놈 DNA 와 일치하더라도 프라이머는 아무 것도 증폭하지 않습니다. 유인물의 증폭이 기하급수적으로 증가하지 않기 때문에, 수십 개의 순환이 끝나면 신호가 정확하게 일치하는 지수 성장의 신호로 가려진다. 일반 PCR 에서와 마찬가지로 업스트림 또는 다운스트림 유인물만 있고 PCR 에는 절대 없습니다. 생산량이 너무 낮기 때문이다. ) 을 참조하십시오
B) 한 쌍의 프라이머 사이의 거리는 너무 길어서는 안 된다. 증폭산물은 100-300bp 사이에 CT 값에 영향을 미치기 때문이다.
자신이 디자인한 프라이머 PCR 을 검증하면 어떤 일이 발생합니까? 전자 PCR 을 만들어 볼 수 있습니다.
1.UCSC- 칩 PCR 도구
UCSC 를 입력, 도구 In-SilicoPCR 을 선택, 업스트림 및 다운스트림 유인물을 입력, 대상에서 genomeassembly 선택, 제출 클릭, 또는 이런 방식으로 나올 수 없는 경우 FlipReversePrimer 를 확인하는 것을 잊지 마십시오. 상류와 하류는 거꾸로 되어 있을 수 있기 때문이다. 제출이 성공하면 이 전자 PCR 이 완료된 후 생성된 시퀀스의 위치와 시작 및 끝 길이를 알려주는 긴 시퀀스가 나옵니다. 그런 다음 NCBI 의 유전자 옵션을 사용하여 자신의 PCR 의 목적 유전자를 입력하고 목적 유전자의 시작 위치를 보면 PCR 이 목적 유전자 서열 여부를 알 수 있다.
주: OCR 에서 생성된 시퀀스는 대상 유전자의 일부일 뿐이며 시퀀스의 시작 위치만 비교하면 됩니다. 프라이머는 목적 유전자로 설계되었기 때문에 PCR 을 통해 두 프라이머 사이의 서열을 얻을 수 있다.
Ncbi-blast-primer blast 로 들어갑니다. 또는 이 사이트로 바로 갑니다. Primerdesigningtool ()
프리미어 매개변수에 방금 설계한 업스트림 및 다운스트림 유인물을 입력합니다.
데이터베이스 드롭다운 옵션에서 RefseqmRNA 를 선택합니다.
Getprimer 를 다시 클릭합니다
잠깐 만요, 그것은 잠시 동안 카드 거 야.
상세한 예비 보고서가 나왔다. 앞서 언급한 Productsontargettemplate 는 모두 HomosapientumorproteinP 53 (TP53) 의 서로 다른 번역본으로, 생산물의 길이는 같다. 이 유전자가 이 프라이머들에 의해 증폭되었다는 것을 보여준다.
두 가지 검증 방법의 장단점:
UCSC 검증법은 당신이 증폭한 모든 서열을 테스트할 수 있습니다.
NCBI 의 BLAST 는 증강산물이 원하는 유전자인지, 증강산물의 길이인지 여부만 제공할 수 있다.
선택: NCBI-blast- 프라이머 -BLAST 방법을 사용하여 프라이머를 디자인하거나 NCBI-BLAST- 프라이머 -BLAST 방법을 사용하여 설계된 프라이머를 검증하는 것이 좋습니다.
기술 공유 qPCR 프라이머 디자인에는 묘수가 있다 -Zhihu ()
유전자 Syt4 (마우스) 가 디자인한 qPCR 프라이머처럼요.
단계 1: NCBI 유전자를 입력하여 해당 유전자 mRNA 의 NM * * * * 호를 찾습니다.
2 단계: NCBI- 폭발-폭발기-폭발 입력 시퀀스 상자에 번호를 입력하고 해당 조건을 확인합니다. PCR 제품의 길이는 70-300 으로 제한됩니다. 따라서 10 은 인트론을 가로지르는 프라이머를 설계하고 Tm 조건에 따라 두 번째 프라이머 쌍을 선택했습니다.
업스트림: GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT
다운스트림: CCAACCGTCCAATCACCTCA
세 번째 단계: NCBI-BLAST-primer-blast 의 상류 및 하류 프라이머 상자에 이 프라이머를 다시 입력하고 Getprimers 를 클릭합니다. 이 프라이머가 증폭한 유일한 유전자는 Syt4 유전자로, 이는 프라이머에 좋은 특이성을 가지고 있음을 보여준다.
4 단계: UCSC-Tools-In-Silico PCR 로 들어가 업스트림 및 다운스트림 유인물을 입력하고 제출을 클릭합니다. 점프 후 제품이 없으면 돌아가서 매개 변수 (예: target parameter, FlipReversePrimer: 검사 여부 등) 를 조정합니다. 최종 생성물은 Syt4 이고 길이는 220bp 입니다. 이것은 프라이머의 PCR 제품에 높은 특이성을 가지고 있으며 단 하나의 제품만을 가지고 있음을 보여줍니다.
5 단계: 추가 검증: 프라이머가 인트론을 통과하도록 설계되었기 때문에 업스트림 프라이머가 인트론을 통과했다는 것을 상기시켜주기 때문에 NCBI- 뉴클레오티드를 입력하고, 입력: Syt4MusmusculusmRNA 를 입력하고, 검색을 클릭하고, 왼쪽 열의 mRNA 를 클릭한 다음, 첫 번째 항목을 클릭합니다. 위를 참고하세요. 이 유전자의 CDS 서열을 찾고, CDS 서열을 찾은 후, 우리는 상하 두 개의 유인물을 검색해 모두 CDS 구역에 있는 것으로 밝혀졌으며, 이들 유인물의 PCR 산물 서열도 CDS 구역에 있다. 자세히 조사한 결과, 업스트림 유인물이 1203- 1224 에 위치한 것으로 밝혀졌으며, 실제로 두 명의 엑손, 즉 엑손1098 ../Kloc-0 에 걸쳐 있습니다.
위에서 우리는 Syt4 유전자의 qPCR 프라이머 서열을 설계했다. 회사에서 직접 합성할 수 있습니다.
이것들은 모두 qPCR 의 프라이머 디자인입니다. 일반적으로, 증폭된 유전자 산물은 100-300bp 사이에서만 정량 또는 반정량용으로 사용된다. 하지만 전체 길이의 DNA 를 증폭시키려면 프리미어 5 소프트웨어가 필요합니다. 증폭 산물의 길이는 스스로 설정할 수 있습니다.
프리미어 프리미어 5 소프트웨어를 사용하여 PCR 프라이머를 설계하는 방법-바이두 경험 ()
온라인으로 프리미어 3 을 디자인하려면 어떻게 해야 합니까? 우선 네가 디자인한 프라이머가 무슨 용도로 쓰이는지 봐야 한다. 일반 PCR 테스트 또는 RealtimePCR 에 사용되는 경우 mRNA 시퀀스를 복제하고 적절한 크기를 선택합니다. 일반 PCR 의 산물 크기는 원칙적으로 250~600bpRealtimePCR 와 100 ~ 200 사이에서 제어됩니다. 폭파시스템이 제시한 유인물 쌍을 터뜨리고, 외현자를 가로지르는 유인물 쌍을 선택하는 것이 가장 좋다.
마지막 GC% 의 수와 같은 프라이머 디자인의 고전적인 규칙에 너무 신경 쓸 필요는 없습니다. 프리미어 3 자체의 디자인 알고리즘은 매우 좋다. 제때에 디자인한 프라이머는 이합체 머리핀 구조로, 대부분의 경우 사용에 영향을 주지 않고 사용하기에도 매우 유용하다.
확장 고정 시퀀스의 경우 기본적으로 프리미어 3 을 사용하여 GC% 를 볼 필요가 없으며 평균 연속 반복 시퀀스가 없습니다. 이 부분은 또 다른 점이다.
어떻게 프리미어 6.0 을 사용하여 프라이머를 디자인합니까? 1. 먼저 대상 유전자 서열 를 선택합니다. 형식에 대한 요구 사항이 없으면 의도 유전자 서열 복사만 하면 됩니다.
2. 파일 디렉토리에서 신규를 열고 일련번호를 선택합니다. 또 다른 프로젝트 옵션은 파일을 가져오는 방법입니다. 즉, 대상 유전자를 파일로 저장하면 파일로 직접 가져올 수 있습니다. 복사는 일반적으로 비교적 편리하다.
3. 시퀀스를 열면 붙여넣기 상자가 나타납니다. 방금 복사한 유전자 서열 붙여넣고 아래의 추가를 클릭하기만 하면 됩니다.
4. 위에 빨간색과 파란색 화살표가 있는 버튼을 선택하여 프라이머를 디자인합니다. 설계를 시작하기 전에 검색의 기본 범위, 프라이머 길이, 기본 수, 설계 결과에 표시되는 프라이머 수 등을 포함한 설계 매개변수를 변경할 수 있습니다.
5. 매개변수를 설정한 후 아래 검색을 클릭하면 소프트웨어가 디자인 분석을 시작합니다. 완료되면 확인을 누릅니다. 설계 결과는 다음과 같이 표시됩니다.
6. 결과에서 파란색은 앞 프라이머, 빨간색은 뒤 프라이머, Rating 은 프라이머의 종합 평가 점수다. 맨 위에도 유인물의 장단점이 드러난다. 가장 좋은 것은 최고, 중간 것은 좋은 것, 가장 나쁜 것은 나쁜 것이다. 일반적으로 사용하는 프라이머는 최고이거나 좋으며 다른 모니터는 사용할 수 없습니다.
7. 오른쪽에는 두 가지 옵션이 있습니다. AllPrimers 는 선택할 수 있는 여러 쌍의 다른 유인물을 볼 수 있습니다. 필요에 따라 적절한 위치와 산물 길이를 가진 프라이머를 선택할 수 있습니다. 선택한 후에는 아래의 교체를 클릭하여 교체해야 합니다.
8.AllStructers 는 현재 선택한 프라이머의 구조 (예: 머리핀 구조, 프라이머 이량 체 및 반복 염기) 를 볼 수 있습니다.
9. 좋은 프라이머를 선택한 후 아래의 프라이머 시퀀스를 클릭하고, 정보 복사 옵션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음, 설계된 프라이머를 익스포트한다. 결과를 파일로 직접 내보낼 수도 있습니다.