전체 게놈 시퀀싱 과정에 대해 자세히 말씀해 주시겠습니까?

아황산 나트륨 시퀀싱 (아황산 수소 게놈 시퀀싱)

직접 시퀀싱은 MSP 를 기반으로 CpG 섬의 메틸화를 더 연구하는 방법이다. 아황산염은 DNA 에서 메틸화되지 않은 포민 탈아미드화를 소변으로 만들고 메틸화된 포민은 그대로 유지한다. PCR 이 증폭된 후 (프라이머 디자인에서 가능한 한 CpG 를 피하여 메틸화 요인의 영향을 받지 않도록 함) 우라실은 모두 흉선으로 전환된다. 마지막으로, PCR 생성물을 시퀀싱합니다. 처리되지 않은 시퀀스에 비해 CpG 사이트가 메틸화인지 여부를 판단할 수 있습니다. 이 방법은 대상 세그먼트의 각 CpG 사이트의 메틸화 상태를 명확하게 하는 매우 안정적이고 정확한 방법입니다. 의미 있는 주요 CpG 사이트를 찾는 데 있어 비교할 수 없는 장점이 있습니다. 염기서열분석법은 CpG 섬 양쪽에 CPGO 점이 없는 시퀀스를 프라이머 페어링 영역으로 한다. 따라서 메틸화와 메틸화되지 않은 과녁 서열은 동시에 증폭될 수 있다. 그것의 단점은 시간이 많이 걸린다는 것이다. 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서는 최소한 10 개 클론을 시퀀싱해야 합니다. 대량의 복제와 플라스미드 추출 시퀀싱이 필요하며, 과정은 번거롭고 비싸다.

첫 번째 부분은 게놈 DNA 추출입니다.

이 단계는 전혀 서스펜스가 없다. 세포나 조직의 DNA 추출 도구를 살 수 있습니다. 실험실 조건이 성숙하면 스스로 추출할 수 있다. DNA 는 상대적으로 안정적입니다. 수술 중에 폭력을 사용하지 않는 한, 제시된 게놈 DNA 는 완전해야 한다.

이 단계는 DNA 의 순도, 즉 RNA 와 단백질의 오염을 줄이거나 피하는 것이 중요하므로 추출 과정에서 프로테아제 K 와 RNase 를 사용하여 제거해야 한다.

사용 세부 정보:

1: 프로테아제 K 는 멸균 쌍증기수로 20mg/ml； 로 만들 수 있습니다.

2.RNase 는 DNase 없이 RNase 로 구성해야 합니다. 즉, 시중에서 RNase 를 구입한 후 10mg/ml 로 준비해야 합니다. 그렇지 않으면 가능한 결과는 2:RNA 뿐만 아니라 DNA 도 소화되는 것이다. 둘 다-20 C 에 보관됩니다.

추출 된 DNA 의 순도를 확인하는 두 가지 방법이 있습니다.

1: 자외선 분광 광도계는 OD 비율을 계산합니다.

2: 1%- 1.5% 아가로 오스 겔 전기 영동.

저는 두 번째 방법을 선호합니다. 게놈 DNA 의 순도를 완전히 명확하게 제시하고 표시된 샘플 크기에 따라 농도를 추정하여 다음 수정을 할 수 있습니다.

두 번째 부분은 아황산 나트륨에 의한 게놈 DNA 의 변형이다.

달리 명시되지 않는 한, 모든 DDW 는 고압 증기로 멸균된다.

1: 약 2 마이크로그램의 DNA 를 50 마이크로리터로 희석시킵니다. 1.5mlEP 파이프에 DDW； 추가

2: 5.5ul 새로 제조 된 3M NaOH； 를 추가하십시오.

3: 42℃ 수조 30 분; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다

수욕 중 준비 작업:

4: 10 mm 수소 퀴논, 수조 후 혼합용액에 30ul 추가 (용액이 연한 노란색으로 바뀜)

5: 3.6m 아황산나트륨 (적마, S9000), 조제방법: 1.88g 아황산나트륨은 DDW 로 희석하고, 3M NaOH 로 PH 5.0 으로 적정하여 5ml 로 정용한다. 이렇게 많은 농도의 아황산나트륨은 용해하기 어렵지만, NaOH 를 넣으면 천천히 용해되기 때문에 인내심이 필요합니다. PH 값은 정확히 5.0 이어야 합니다. 수조 후 상술한 용액에 520 마이크로리터를 넣는다.

6: EP 는 알루미늄 호일로 싸서 빛을 피하고 용액을 가볍게 거꾸로 놓는다.

7: 200 ul 크레파스를 넣어 수분 증발을 방지하고 산화를 제한한다.

8 시 50 도 흑수욕 16h.

보통 이 단계는 오후 4 시부터 숙련되면 5 시 미만이면 완성할 수 있다. 16h 의 수조는 다음날 아침 8 시가 막 지나서 잘 어울립니다.

이 단계의 세부 정보:

1: 게놈 DNA 의 양은 매우 정확할 필요는 없습니다. 오히려 많든 적든, 순화 및 재활용 단계에서 손실되기 때문에 이 방법은 최대 4ug 까지 수정할 수 있습니다.

2. 모든 시약 들은 신선하게 조제해야 하기 때문에 배액 기술은 반드시 관문을 통과해야 하며, 빠르고 정확해야 한다.

3. 아황산나트륨용액은 강산성이므로 반드시 염기로 PH 값을 5.0 으로 조절해야 한다. 그렇지 않으면 PH 값이 부적절하면 후속 정화와 흡수에 영향을 줄 수 있다.

4. 가장 좋은 수조는 16 시간이며 8 시간까지 짧을 수 있지만 뒤의 수정은 철저하지 않을 것이다.

세 번째 부분은 수정 된 DNA 의 정제 및 회수입니다

달리 명시되지 않는 한, EP 관은 고압 멸균을 사용합니다.

1. 이동총머리를 석랍유층 아래에 놓고, 먼저 가볍게 압력을 가해 작은 석랍유 한 토막을 배출한 다음 혼합액을 깨끗한 1.5mlEP 관으로 흡입한다.

2. 다음은 Promega 마법사를 사용하여 DNA 순화 및 재활용 시스템 (Promega, A7280) 을 정리합니다.

1)70℃ 수조 예열 DDW；; 을 눌러 섹션을 인쇄할 수도 있습니다 80% 이소프로판올의 제조;

2) 1ml Promega 의 Wizard DNA 청소 수지를 넣고 부드럽게 거꾸로 섞어서 DNA 와 수지가 잘 결합되도록 합니다.

3) 주사기만 장착되어 있고 바늘마개가 없기 때문에 진공 음압 유인기가 있으면 사용하기에 매우 편리하다. 그렇지 않은 경우 자체 3ml-5ml 주사기가 필요합니다. 주사기통은 테스트 키트 제공 재활용 기둥과 밀접하게 연결된 후, 이동액관으로 위의 혼합물을 주사기 안으로 옮기고 기둥 아래에 2ml 이상의 EP 관을 놓아 폐액을 받습니다. 침마개를 넣고 가볍게 눌러 액체를 짜내다. 이때 기둥에서 흰색 수지 퇴적물을 볼 수 있습니다.

4) 주사기를 약통에서 분리한 후 플러그를 뽑은 다음 주사기를 약통에 연결하고 주사기에 2ml 80% 의 이소프로판올을 넣고 래치를 삽입하고 가볍게 눌러 이소프로판올을 돌출시킵니다. 세탁 절차입니다.

5) 주사기를 약통에서 분리하고 약통을 1.5ml 의 깨끗한 EP 관에 놓고 12000 rpm 으로 2 분 동안 원심시켜 남아 있는 이소프로판올을 제거하고 수지를 건조시킵니다. 이때 손질된 DNA 는 수지와 결합된 상태에 있다.

6) 색상 스펙트럼 기둥을 제거하고 다른 깨끗한 1.5mlEP 튜브에 놓고 50 마이크로리터로 예열된 DDW 를 피펫에 넣고 실온에서 5 분간 배치합니다.

7) 원심 분리 12000 회전 20s, 이것은 용출 단계입니다. 이때 EP 관의 액체는 최종 부피가 50ul 인 세탁된 손질 DNA 용액이다.

3: 5.5 마이크로리터로 새로 준비한 3M NaOH 를 넣고 실온에서 65438 05 분을 배치합니다.

4: 33ul 10M 아세트산 암모늄을 첨가하여 NaOH 를 중화시키고 용액의 PH 값을 약 7.0 으로 만듭니다.

5. 4U 10 mg/ml 글리코겐을 침전지시제로 넣는다 사실 이 글리코겐이 얼마나 큰 역할을 할 수 있는지 말하기는 어렵다. 하지만 국산 글리코겐이 팔려서 포장이 크지 않아 싸다. 사면 문헌 상의 절차를 엄격히 따라야 한다.

6: 270ul 얼음 무수에탄올을 넣고-20 C 아래에 놓고 밤을 지새우세요. 어떤 사람들은 가장 짧은 침하 시간이 2 시간이 될 수 있다고 생각하지만, 나는 더 오래 걸릴 수 있다고 생각한다. 이 단계를 할 때는 보통 정오까지 계속된다. 샘플이 많다면 하룻밤 두는 게 좋을 것 같아서 시간 안배가 완화되고 다른 실험도 할 수 있어요. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 샘플명언) 당일 끝내고 싶으시다면 문제없지만, 장시간 결제하는 게 좋을 것 같아요. 최소 6 시간 정도.

7: 4, 12000rpm 원심 30 분, 청액을 붓고 침전물을 수집한다. 완전히 흡수 할 필요는 없습니다.

8: 500ul 70% 70% 에탄올을 넣고 침전물을 불지 말고 에탄올만 넣으면 됩니다. EP 튜브를 부드럽게 기울이고 한 번 돌린 다음 다시 4 도 12000 rpm 으로 5 분 동안 원심합니다. 원심후 청액을 붓고 같은 양의 에탄올을 넣고 다시 한 번 한다. 이것은 세척 단계, * * * 두 번입니다.

9: 상청액을 붓고, 실온에서 잠시 원심한 후, 벽에 붙어 있는 에탄올을 EP 관 바닥으로 분리하고, 이동액관으로 잔액을 조심스럽게 흡수하고, 실온에서 5 분 동안 건조시키거나, 침전이 불투명에서 반투명이나 투명으로 변할 때 20ul- 30ulDDW 를 넣어 침전을 녹인다. 지금까지 수정 된 DNA 의 정제 및 회수가 완료되었으며 수정 된 DNA 용액은 추가 실험에 사용될 수 있습니다.

10:-DNA 용액을 20 ℃에 저장합니다.

이 단계의 세부 정보:

1: 주사기를 사용할 때는 힘이 균일하고 가벼워야 합니다. 폭력을 사용하면 기둥 속의 막이 으스러져 효과가 없어진다.

아세트산 암모늄과 글리코겐은 신선한 준비가 필요하지 않습니다. 원당은 배합한 후-20 C 에서 보관해야 하고, 초산암모늄은 실온에서 보관할 수 있는데, 이런 농도의 초산암모늄은 매우 용해되지 않기 때문이다. 일단 4 C 에 넣으면 꺼낼 때 많은 용질이 석출된다.

3: 이소프로판올과 에탄올의 70% 는 신선한 조제가 필요하지 않지만, 사용량이 많으면 현장에서 조제하는 것이 편리하다.

이 단계의 관건은 수지와 DNA 의 결합으로 2 부 아황산나트륨 PH 값을 조정하는 것의 중요성을 다시 한 번 강조했다. 수지와 DNA 의 결합은 적절한 PH 값을 필요로 하기 때문에, 이전 단계가 제대로 이루어지지 않았다면, 이 수지는 DNA 와 잘 결합될 수 없고, DNA 와 액체가 함께 돌출되어 씻을 때 실제로 DNA 가 없다는 재앙적인 결과를 초래할 수 있다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), Northern Exposure

수정 된 DNA 의 네 번째 부분은 PCR 에 사용됩니다.

이 단계는 전혀 서스펜스가 없다. 나는 주로 몇 가지 까다로운 문제에 대해 이야기하기 위해 여기에있다.

1: 프라이머 문제: 프라이머를 디자인하기가 어렵다고 느낍니다. 나는 몇 쌍의 유인물을 설계해 보았지만, 모두 실패로 끝났다. 시간이 충분하다면, 비교적 새로운 유전자 문헌이 많지 않다면, 내가 직접 유인물을 설계하는 것은 문제없다. 그렇지 않다면 참고 문헌을 참고하는 것이 낫다. 먼저 SCI 점수가 높은 문헌을 조회한 다음 유명한 실험실의 문헌을 열람한다. 국내에 있으면 더 좋다. 직접 문의 가능합니다. 시퀀스를 찾은 후에는 반드시 Genbank 의 시퀀스와 일치시켜 인쇄 오류로 인한 개별 염기 차이를 방지해야 합니다. 그리고 구글에서 검색해 보면 사용자가 많지 않고 시스템 조건도 다르다. 사용자가 많고, 시스템 조건이 동일하며, 반복성이 비교적 강하다는 것을 설명한다. 저도 이에 따라 일을 하고 있습니다. 비교적 순조롭습니다.

2.Taq 효소 문제: 고 충실도 금메달 Taq (플래티넘) 를 사용하는 문헌이 있지만, 시스템이 정확하고 트랜스젠더 어닐링 등의 조건이 맞으면 일반 열시동 효소가 가능하다고 생각합니다. 나는 Takara 의 LA Taq 를 사용하기 시작했는데, 매우 유용하고 10x LA 완충액, mg++ 가 포함되어 있다. 가끔 다 떨어지면 타카라의 일반 Taq 효소를 임시로 사용할 수 있다. 어떻게 선택합니까?

3.PCR 조건: 변성은 보통 95 도, 3m 3 분입니다. 나는 나머지는 모두 문헌에 근거한 것이라고 생각한다. 어닐링은 너의 프라이머 어닐링 온도에 따라 작은 범위에서 시도할 수 있다. 일반적으로 문헌 보도와 크게 다르지 않다. 이것은 단지 증폭 단편 특이성의 문제일 뿐이다. 문헌을 따를 것을 건의하다.

4.PCR 은 수입 EP 파이프를 선택하는 것이 가장 좋습니다. 관벽이 얇고 두께가 균일하여 온도의 빠른 변화가 제때에 관내 반응액으로 전달되도록 하여 시스템이 실제로 설정된 온도에서 작동할 수 있도록 합니다.

5.PCR 기기: 어떤 기구에서 만든 것이라면 항상 이 기구를 사용하는 것이 좋습니다. 기기마다 불의 정도가 다르지만, EP 관은 반드시 기기의 잭과 밀접하게 결합해야 하며, 빈틈이 남아 있어서 온도 전달에 영향을 줄 수 있다고 생각합니다.

이 부분은 좀 수다스럽지만 미성숙한 개인적인 경험일 뿐이다. 문제가 있으면 지적해 주세요. 나는 오늘 먼저 왔는데, 지금 몇 가지 내용을 쓰고 있는데, 비교적 힘들여, 단번에 이룰 수 없다. 용서해 주세요. 나는 휴식을 취하고 파란 흰 점을 써서 클론의 마지막 부분을 선별할 준비를 했다.

다섯 번째 부분은 PCR 제품의 겔 회수입니다.

이 단계는 비교적 간단하다. 젤 PCR 제품 재활용 테스트 키트, 국산, 가격이 적당합니다. 예를 들면 천근의 제품 (중고) 입니다. 지시에 따라 조작해 주세요.

몇 가지 세부 사항:

1: 새로 준비한 전기영액은 PCR 산물의 진지당 젤 전기 영동에 적용된다. 겔 농도는 1%-2% 일 수 있습니다.

2. 젤 DNA 를 회수할 때 300nm 자외선등 아래에서 띠 위치를 관찰하고, 목적조각이 있는 젤을 잘라서 가능한 작게 만들어 특이성을 확보한다.

자외선 조사 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 DNA 가 손상될 수 있습니다.

4. 회수된 DNA 를 바로 사용하지 않으면-20 C 에 보관돼 몇 달 안에 매우 안정적입니다.

여섯 번째 부분은 PCR 제품과 T 캐리어의 연결 변환과 파란색과 흰색 반점의 선별이다.

1: t 캐리어 연결 (이 실험에서는 Promega 의 테스트 키트 사용)

15ul 시스템

T-easy 1ul

연결 효소 1ul

버퍼 2 개 7.5ul

DNA 5.5ul 마이크로 리터

4 도, 하룻밤 사이.

2. 연결 생성물의 전환

1)-70 도 냉장고에서 감성 세균을 꺼내서 녹인 후 얼음 위에 놓는다.

2) 연결 제품 15ul 모두 추가, 얼음 30 분;

3)42 도 90 초;

4) 얼음 2 분;

5)800ul LB 배지;

6)280rpm, 37 도, 흔들기 45 분

7)8000 회전, 1 분; 초순대에서 상청액을 제거하고100-150UL 을 남깁니다.

8) 패키지: 37 도 부화 밤; (태블릿은 암피실린 함유 고체 LB 배양기)

1 층: X-gar 35ul

IPTG 25ul

후면 코팅: 서스펜션

밤을 지낸 후, 판자에서 많은 파란색이나 흰색 반점을 볼 수 있다. 흰색 점을 예로 들자면, 특히 파란색 점 주위의 흰색 점은 자체 링크율이 낮습니다.

3. 흰 점을 좀 가져와서 새 판에 계획한다.

새 회로 기판: 첫 번째 페인트: X-gar 35ul

IPTG 25ul

그런 다음 판자 아래쪽에 칸막이를 그리고 표시를 합니다. 필요에 따라 한 판에 50 개의 복제물을 만드는 것은 일반적으로 문제없다.

바늘은 흰색 점을 선택하고 보드의 해당 영역에 2 개의 레인을 표시합니다.

37 도, 인큐베이터는 밤을 지낸다.

4. 시퀀싱 회사에 연락하여 시퀀싱을 보냅니다. 일반적으로 클론은 35-45 원에 위치한다.

이 섹션의 세부 정보:

1: 코팅은 균일해야 하고 Xgar 와 IPTG 는 판 면에 고르게 분포되어야 합니다.

2. 파란색과 흰색 반점이 너무 가득 자라지 않도록 하십시오. 그렇지 않으면 한 번에 두 개의 복제물을 쉽게 선택할 수 있습니다.