당시 PCR 에 미치는 영향은 보통이었지만 작동에는 문제가 없었다. 하지만 자세히 생각해 보면, 다른 실험과 마찬가지로, 나의 지식은 매우 적고, PCR 도 마찬가지이다. 그래서 저는 PCR 과 관련된 다양한 기술과 원리를 다시 배울 필요가 있다고 생각합니다.
본론으로 들어가다
PCR (폴리효소 체인형 반응) 폴리효소 체인형 반응은 체외 DNA 증폭 기술이라고도 하며, 미국 세터스의 Kary Mullis 가 1985 년 창시해 소량의 DNA 조각을 백만 배 이상 증폭시킬 수 있다. Kary Mullis 본인은 1993 노벨 화학상을 수상했다.
앞서 PCR 의 노래를 공유했습니다. 여기서 먼저 검토한 후 PCR 관련 지식을 체계적으로 정리합니다.
첫째, PCR 의 원리
DNA 중합 효소의 촉매로, 모체 DNA 를 템플릿으로 하여 특이성 유인물을 연장의 출발점으로 삼는다. (윌리엄 셰익스피어, DNA, DNA, DNA, DNA, DNA) 트랜스젠더, 어닐링, 확장 등의 단계를 통해 체외에서 모판 DNA 와 보완되는 하위 DNA 를 복제하는 과정.
중합 효소 체인형 반응은 알려진 짧은 DNA 단편을 증폭하는데, 이 단편은 단일 유전자일 수도 있고 유전자의 일부일 수도 있다. 생명체와 달리 PCR 은 매우 짧은 DNA 단편만 복제할 수 있으며, 일반적으로 10kbp 를 초과하지 않습니다. DNA 는 이중 가닥 분자이므로 그 크기는 상호 보완적인 DNA 이중 가닥의 구조 단위 (뉴클레오티드) 로 측정되며, 단위는 염기쌍, BP 입니다.
둘째, PCR 반응 성분
틀
너무 많음:
비특이적 띠가 증가하다.
너무 적음:
PCR 의 생산량이 감소하다.
프라이머
핵산 조각의 양끝을 미리 증폭시키는 알려진 서열이 특이성을 결정한다.
높음:
비특이적 산물의 증폭과 잘못된 배합은 프라이머 간 프라이머 이합체의 형성을 증가시켜 생산량이 감소했다.
낮음:
생산량이 감소하다.
중합 효소
내열성이 높다
높음:
프라이머 비특이적 생성물의 증폭.
낮음:
제품의 수량이 감소하다.
DNTP
DATP, dGTP, dCTP, dTTP
너무 높음:
반응 속도를 높이면 염기의 잘못된 혼합률과 실험실 검사 비용도 증가한다.
너무 낮음:
반응 속도의 감소는 실험의 정확성을 높일 수 있다.
완충기
마그네슘 이온
Taq 효소는 Mg2+ 의존성으로 반응의 특이성과 증폭 조각의 생산에 큰 영향을 미친다.
초과:
비특이적 증폭을 증가시켜 생산량에 영향을 미친다.
너무 낮음:
효소 활성이 현저히 감소하다.
10 ~ 50mm Tris- Cl (pH8.4)
Taq 효소의 알칼리성 환경을 유지하다.
25 ~ 50mm KCl
프라이머 어닐링을 촉진하고 > > 50 mM 는 Taq 효소 활성을 억제한다.
100 마이크로그램/밀리리터 소 혈청 알부민 (BSA)
그것은 효소에 일정한 보호 작용을 하는데, 품질이 좋지 않으면 반작용을 할 수 있다. 아세틸 화 BSA 를 사용하는 것이 좋습니다. 젤라틴, 토온 -20, 디황소당 (DTT) 은 비슷한 효과를 가지고 있다.
셋째, PCR 반응의 기본 단계
일반적인 중합 효소 연쇄 반응은 20 개에서 35 개의 순환으로 구성되며, 각 순환은 다음 세 단계로 구성됩니다.
트랜스젠더:
어닐링 또는 연결:
내선 (내선):
4.PCR 반응 조건의 최적화
1, 변성 온도 및 시간:
템플릿 DNA 의 용융을 보장하는 것이 전체 PCR 증폭의 성공을 보장하는 열쇠입니다.
90 ~ 95 C 에서 30 ~ 60 초 동안 가열하면 가장 복잡한 DNA 분자도 단일 체인으로 변한다.
온도가 너무 높거나 기간이 너무 긴 고온은 Taq 효소 활성과 dNTP 분자를 파괴한다.
리 폴딩 온도 및 시간:
PCR 증폭의 특이성은 리 폴딩 과정에서 프라이머와 템플릿의 조합에 따라 달라집니다.
리 폴딩 온도가 높을수록 제품 특이성이 높아집니다. 리 폴딩 온도가 낮을수록 제품 특이성이 낮아집니다.
베이스 페인트의 Tm 값에 따라 설정해야 합니다.
3. 연장 온도 및 시간:
일반 Taq 효소의 최적 온도는 70 ~ 75 C 사이이며, 프라이머가 16 뉴클레오티드보다 작을 때 과도한 확장 온도는 프라이머와 템플릿의 결합에 좋지 않아 온도를 70 ~ 75 C 로 천천히 높일 수 있다.
확장 반응 시간은 증폭될 세그먼트의 길이에 따라 달라질 수 있으며 1 KB 및 1 min 보다 작으면 충분합니다. 1kb 보다 크면 시간을 연장해야 합니다. Taq 효소는 1kb/min 에 따라 시간을 늘릴 수 있다.
여기서 주목해야 할 것은 연장 시간이 너무 길면 비특이적 증폭이 발생할 수 있다는 점이다. 따라서 적절한 연장 시간을 설정할 필요가 있다.
4. 주기 수:
다른 매개변수를 선택한 후 PCR 주기 횟수는 주로 템플릿 DNA 의 농도에 따라 달라집니다.
이론적으로 20? 25 사이클 후에 PCR 제품의 축적이 최대치에 이를 수 있다. 실제 작업에서 반응당 생산률이 100% 에 이를 수 없으므로 템플릿 농도에 관계없이 20~30 회 순환이 비교적 합리적인 주기 수입니다. 순환 횟수가 많을수록 비특이적 증폭이 많아진다.
동사 (verb 의 약어) PCR 확장 기술
PCR 에서 확장 된 많은 기술이 있습니다. 여기에는 일상적인 실험에서 일반적으로 사용되는 몇 가지 기술 만 나열되어 있습니다.
1. 터치 PCR
로그인 PCR 은 주로 PCR 조건을 최적화하는 데 사용됩니다. 많은 경우, 프라이머의 설계는 PCR 에 어려움을 가져온다. 예를 들면 특이성이 부족하고 잘못 어울리기 쉽다. 어닐링 온도가 너무 높으면 PCR 효율이 너무 낮지만 어닐링 온도가 너무 낮으면 비특이적 증폭이 너무 높을 수 있습니다.
따라서 이전 사이클의 초기 어닐링 온도는 프라이머의 최대 용융 온도 (Tm) 보다 몇 도 높게 설정됩니다. 처음 몇 주기 동안 온도는 설정된 최종 Tm 으로 점차 떨어집니다. 고온에서 특이성이 높은 템플릿을 얻은 후 낮은 온도에서 효율적으로 증폭합니다.
2. 역전사 중합 효소 연쇄 반응
역전사-중합 효소 사슬 반응 (RT-PCR) 의 원리는 조직이나 세포에서 총 mRNA 를 추출하여 역전사 효소로 Oligo(dT) 나 무작위 유인물을 사용하여 cDNA 로 역전시키는 것이다. 그런 다음 cDNA 를 템플릿으로 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 목적 유전자를 얻거나 유전자 표현을 감지합니다.
3. 실시간 PCR/ 정량 PCR
실시간 형광 정량 PCR 기술은 PCR 반응체계에 형광기단을 추가하여 형광신호를 이용하여 전체 PCR 과정을 실시간으로 모니터링한 후, 마지막으로 표준 곡선을 통해 알 수 없는 템플릿을 정량적으로 분석하는 방법을 말한다.
4. 중첩 PCR
먼저, 저특이성 프라이머를 사용하여 템플릿 수를 늘리기 위해 몇 가지 순환을 한 다음, 고특이성 프라이머를 사용하여 증폭한다.
5.SOE PCR
겹치는 확장 PCR 은 겹치는 확장 PCR 점 돌연변이와 겹치는 확장 PCR 시퀀스 누락 돌연변이, 즉 겹치는 확장 PCR 유전자 접합 (SOE PCR) 으로 나뉩니다.
5. 1 겹치는 확장 PCR 점 돌연변이 (원리가 간단하기 때문에 바로 위 그림).
이 단계는 반드시 Pfu 효소를 사용해야 하며, Taq 효소를 사용해서는 안 된다. Taq 효소는 PCR 산물의 끝에 A 를 쉽게 첨가하여 산물의 이동 코드 돌연변이를 일으킬 수 있기 때문이다.
5.2 중첩 확장을 통한 PCR 시퀀스의 돌연변이 누락
6. 높은 GC 함량 PCR
높은 GC 함량 (>: 65%) 을 가지고 있으며, G 와 C 염기 사이의 강한 수소 결합으로 DNA 템플릿은 증폭하기 어렵다. GC 가 풍부한 시퀀스에도 2 차 구조가 포함됩니다. 따라서 GC 가 풍부한 서열은 DNA 중합 효소가 템플릿을 따라 "막히게" 하여 DNA 합성을 방해할 수 있습니다.
GC 함량이 높은 조각을 증폭하려면 이중 체인 템플릿을 분리해야 합니다. 그러면 프라이머가 템플릿과 결합되고 DNA 중합 효소가 시퀀스를 읽을 수 있습니다. 강력한 GC 상호 작용을 극복하기 위해 가장 일반적인 방법은 DMSO 나 보조용제와 같은 PCR 첨가제를 사용하여 DNA 변성을 돕는 것입니다. 그러나 이러한 시약 들은 일반적으로 프라이머의 Tm 을 낮추므로 그에 따라 어닐링 온도를 조정해야 합니다.
합성력이 높은 DNA 중합 효소는 템플릿과의 결합 능력이 강하기 때문에 GC 함량이 높은 PCR 을 완성하는 데 도움이 된다. 초고열 안정성 DNA 중합 효소도 GC 함량이 높은 PCR 에 유리하다. 더 높은 변성 온도 (예: 95 C 대신 98 C) 가 이중 체인 해리와 PCR 증폭을 촉진할 수 있기 때문이다.
7.AS-PCR
PCR (등위 유전자 특이성 PCR (AS-PCR) 은 가이드라인과 템플릿의 염기가 잘못 배합되어 PCR 반응을 효과적으로 억제하여 템플릿 감별 (등위 유전자 감별) 의 목적을 달성한다.
PCR 에서 프라이머 확장은 3' 끝에서 시작되므로 3' 끝의 염기는 프라이머 확장에 매우 중요합니다. 이 염기가 템플릿과 상호 보완적이라면 프라이머는 연속적으로 확장 될 수 있고 PCR 은 정상적으로 수행 될 수 있으며 특정 길이의 증폭 밴드를 얻을 수 있습니다. 그렇지 않으면 확장 할 수 없습니다. 따라서 정상 등위 유전자와 다른 돌연변이 염기를 프라이머 3' 의 끝에 배열하면 돌연변이 서열이 들어 있는 프라이머가 PCR 에 사용될 때 이성 밴드를 얻으면 테스트된 유전자에 돌연변이가 포함된다는 것을 알 수 있다. 이런 돌연변이가 없음을 나타내는 특정 증강대가 나타나지 않았다.
참고: 여기에는 프라이머 3' 끝의 염기쌍만 사용되기 때문에 적절한 Tm 을 찾아야만 검사 목적을 달성할 수 있다.
참고
Mullis, Kary B. 등' 핵산 서열을 증폭, 검출 및/또는 복제하는 방법' 미국 특허 4,683, 195.