众所周知，液相色谱中流动相的选择非常重要，直接影响到色谱分离的结果。然而对于反相色谱流动相的选择中，大家的关注点几乎都是在缓冲盐的选择上，对于有机相的选择关注的往往很少，几乎都是甲醇乙腈随机使用。主要是反相液相色谱中可选的有机相种类不多，绝大多数都是甲醇，乙腈再加上少部分用四氢呋喃。而实际上，有机相的选择也非常重要，那我们应该如何选择，是甲醇还是乙腈，还是其他？

有机相的选择，首先考虑的是溶剂的强度和极性。溶剂的强度决定着化合物洗脱需要有机溶剂的量，在反相色谱中随着溶剂极性的增大而减小。我们常用的几种有机溶剂的溶剂强度分别为：甲醇2.64，乙腈3.12，四氢呋喃4.4，从数值来看几种有机溶剂的洗脱能力甲醇<乙腈<四氢呋喃，具体对应起来如下图所示：

如果某一化合物能在20%乙腈水的条件下洗脱下来，如果将乙腈换成甲醇，则需约28%甲醇水才能洗脱，而换成四氢呋喃，则只需15%的四氢呋喃就能洗脱。

Tips：上述只是理论上的数据，在实际实验中，如果需达到相似的保留，将乙腈更换成甲醇，我们建议在上图的基础上，额外增加10%甲醇；而将乙腈更换成四氢呋喃时，则需减少5%四氢呋喃。

从三种溶剂的结构上看，甲醇在氢键作用下既是强的质子给予体又是强的质子接受体；乙腈具有偶极作用，在氢键作用下，又是非常弱的质子接受体；四氢呋喃在氢键作用下只能接受质子，不能给予质子。

色谱柱：Drogon 苯基柱 150*4.6mm 5um流动相：20mM磷酸二氢钾（pH 2.5）: 有机相%（图示）流速：1.0ml/min检测波长：UV@220nm化合物：1. 糖精钠 2. 对羟基苯甲酸 3. 山梨酸 4. 脱氢乙酸 5.对羟基苯甲酸甲酯

如上述实验结果所示，在使用乙腈和甲醇分别作为洗脱溶剂的时候，出峰顺序发生了变化。通过结构来看，糖精钠是一个强的质子接受体，而苯甲酸是一个强的质子给予体，在甲醇做流动相的时候，甲醇既是一个强的质子接受体又是一个强的质子给予体，作用互相抵消，他们的洗脱是纯粹依靠甲醇本身的洗脱能力；而乙腈只是一个弱的质子接受体，不能给予质子，相比之下乙腈与苯甲酸之间还多了一层氢键作用，因此，苯甲酸在乙腈中的洗脱更快，导致出峰顺序发生了变化。脱氢乙酸和对羟基苯甲酸甲酯这两种物质，相比而言，对羟基苯甲酸甲酯带有苯环，而乙腈中的π电子干扰了它与苯基固定相的结合，因此出峰更快，出峰顺序也发生了变化。

Tips：在用苯基柱时，使用甲醇做有机相，能更好的体现苯基的π-π选择性。同时还可以根据目标化合物接受或给予质子的能力，挑选合适的溶剂作为流动相，能够取得意想不到的分离效果。

除此之外，溶剂的粘度，紫外吸收截止波长也是我们选择有机相需要考虑的内容。