단일 클론 항체 준비

1975 년, kühler 과 milstein 은 먼저 양적혈구 (srbc) 로 면역된 쥐 비장 세포가 골수종 세포와 융합되어 첫 번째 B 세포 교배종 세포주를 설립하고 항SRBC 의 단일 복제 항체 (McAb) 를 성공적으로 만들었다고 보도했다. 지금까지, 세계에서 이미 수천 그루의 단일 복제 항체 () 가 개발되었다.

단일 복제 항체 이화 성질은 고도로 통일되고, 생물 활성성이 단일하며, 항원과 결합된 특이성이 강하여 수작업 처리와 품질 관리가 쉽고, 출처가 쉬워 나오자마자 환영받고 중시된다. 의학 분야에서 단일 복제 항체 은 질병 진단, 예후 판단, 질병 예방 및 치료, 질병 메커니즘 연구 등에 큰 역할을 한다. 이에 따라 두 발명가는 1984 로 노벨 의학상을 수상했다.

제 1 절 교배종 기술의 기본 원리

잡교종 항체 기술의 기본 원리는 두 세포를 융합하는 동시에 그 주요 특징을 유지하는 것이다. 이 두 세포는 각각 항원 면역의 쥐 골수종 세포이다. 비장 림프세포의 주요 특징은 항체 분비 기능과 선택적 배양기에서 자라는 능력 (뒤의 선택 원리 참조) 이며, 쥐 골수종 세포는 배양 조건 하에서 무한히 분열되어 증식할 수 있으며, 영생세포라고 한다. 선별배양기의 작용으로 B 세포와 골수종 세포의 교배체만이 지속적인 증식능력을 가지고 항체 분비 기능과 세포 영생을 겸비한 세포 복제를 형성할 수 있다. 그 원리는 다음과 같은 몇 가지 주요 단계에서 설명합니다.

(a) 세포 선택 및 융합

하이브리드종 기술은 항원에 대한 단일 복제 항체 제조를 위해 만들어졌기 때문에 융합 세포 측은 항원 면역의 B 세포를 선택해야 하는데, 보통 면역동물의 기념비 세포에서 나온다. 비장은 B 세포가 모이는 중요한 장소이다. 어떤 면역 자극이든 비장에는 뚜렷한 항체 반응이 있다. 융합 세포의 다른 면은 세포가 융합된 후의 세포 증식을 유지하는 것으로, 종양 세포만 이런 특성을 가지고 있다. 같은 시스템의 세포를 선택하면 융합의 성공률을 높일 수 있다. 다발성 골수종은 B 세포주의 악성 종양이기 때문에 비장 세포의 이상적인 융합 동반자이다. 현재 B 세포종에 일반적으로 사용되는 균주는 P3-X63-AG8 (K ᦖ HLERANDMILSTEIN, 1975), P3-NSI/1-입니다 Sp2/0-ag 14 (슐만타르, 1978) 등. 이 세포주들은 모두 hat 에 민감한 세포주이다.

세포 융합제의 사용은 세포막에 어느 정도 손상을 주어 세포가 서로 쉽게 접착하여 융합할 수 있게 한다. 가장 좋은 융합 효과는 세포 손상 정도가 가장 낮고 융합 빈도가 가장 높다는 것이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 1000 ~ 2000) 은 현재 가장 많이 사용되는 세포 융합제로 일반 응용 농도가 40% (w/v) 입니다.

(b) 선택적 배지의 적용

세포 융합은 무작위 물리 과정이다. 쥐 비장 세포와 쥐 골수종 세포의 혼합 세포 현액에서 융합 세포는 다양한 형태로 나타난다. 융합된 비장 세포와 종양 세포, 융합된 비장 세포와 비장 세포, 융합된 종양 세포와 종양 세포, 융합되지 않은 비장 세포, 융합되지 않은 종양 세포, 세포의 중합체 형태 등이 있다. 정상 비장 세포는 배양기에서 5 ~ 7 일밖에 살아남지 못하며, 세포의 다합체 형태는 특별한 선별없이 쉽게 사망한다. 그러나 융합되지 않은 종양 세포는 특별한 선별과 제거가 필요하다.

일반적으로 세포 DNA 를 합성하는 두 가지 방법이 있습니다. 주요 경로는 설탕과 아미노산이 뉴클레오티드를 합성하고 DNA 를 합성하는 것이다. 엽산은 중요한 보조효소로서 이 합성 과정에 참여했다. 또 다른 보조 경로는 2 차 황토닌과 가슴의 존재 아래, 2 차 황푸린인산 리보리보전환효소 (hgprt) 와 가슴타아제 (tk) 의 촉매로 DNA 를 합성하는 것이다. 세포 융합의 선택성 배양기에는 차황 (H), 메토트렉세이트 (A), 가슴배당체 (T) 의 세 가지 핵심 성분이 있다. 따라서 이 세 가지 성분의 접두사를 hat 배양기라고 한다. 메토트렉세이트는 엽산의 길항제로 종양 세포가 정상적인 경로를 통해 DNA 를 합성하는 것을 막는다. 융합을 위한 종양세포는 독성 배양기에서 선택한 hgprt-세포주이므로 배양기에서 자랄 수 없다. 융합된 세포는 부모의 유전적 특성을 가지고 있어야만 hat 배양기에서 중장기 생존과 번식을 할 수 있다 (그림 1 1- 1).

(3) 제한된 희석 및 항원 특이성 선택

동물 면역에서는 고순도 항원을 선택해야 한다. 항원은 종종 여러 개의 결정 클러스터를 가지고 있는데, 한 동물이 항원에 자극을 받아 생기는 체액 면역 반응은 본질적으로 많은 B 세포군의 항체 분비이다. 그러나 표적 위치를 목표로하는 b 세포는 소수에 불과합니다. 세포 융합은 무작위 과정이기 때문에, 상당 비율의 융합 세포는 신중하게 선별하고 제거해야 한다. 심사 과정은 일반적으로 두 단계로 나뉜다. 하나는 융합 세포의 항체 선별이고, 다른 하나는 이를 바탕으로 한 특이항체 선별이다. 융합된 세포를 충분히 희석시켜 배양판의 각 구멍에 분포하는 세포 수가 0 ~ 몇 개의 세포 사이 (30% 의 구멍이 0 으로 각 구멍이 단일 세포임을 보장함) 에 있도록 하고, 배양한 후 청액을 채취하고, ELISA 를 이용해 항체 분비가 높은 세포를 선별한다. 이 과정을 복제라고 합니다. 이 양성세포들을 다시 복제해 특이성 항원이 포함된 ELISA 를 통해 과녁 항원을 겨냥한 항체 양성세포주를 찾았다. 증식 후 냉동, 체외 배양 또는 동물 복강에 접종한다.