대개 방법은 자연선택과 인공선택 두 가지가 있는데 단독으로 사용하거나 교차적으로 사용할 수 있다.

DNA 셔플링 기술

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PCR 기술의 개발과 응용으로 1994년 미국의 스테머(Stemmer)가 새로운 인공분자진화기술을 제안했다—— DNA 셔플링(셔플링 기술이라고도 함)인 이 기술은 수백 년에 걸쳐 유기체의 분자 진화 과정을 시뮬레이션할 수 있으며 짧은 실험 주기에서 특정 유전자에 의해 코딩된 효소 단백질을 방향적으로 선별하여 활성을 수백 배 또는 심지어 증가시킬 수 있습니다. 더 많은 기능성 돌연변이 유전자. 기본 원리는 DNA 뉴클레아제 I을 사용하여 서로 다른 소스에서 동일한 기능을 가진 상동 유전자 그룹을 소화하여 무작위 작은 조각을 생성하는 것입니다. 이 작은 조각은 PCR 증폭을 위해 서로에 대한 프라이머 및 주형 역할을 합니다. 유전자 복제 단편은 다른 유전자 복제에 대한 프라이머 역할을 하며 주형 전환을 일으키고 재조합이 발생합니다. 신체에 도입된 후 양성 돌연변이가 새로운 라운드의 시험관 내 재조합을 위해 선택됩니다. 일반적으로 2~3주기를 거치면 크게 개선된 산물을 갖는 재조합 돌연변이체를 얻을 수 있다.

2 자연선택

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인위적인 돌연변이나 혼성화 과정을 거치지 않고 자연에서 미생물을 분리, 정제(미생물의 분리 및 정제 참조)한 후 순수하게 수행하는 것 배양 및 결정(미생물학적 결정 방법 참조)을 수행하고 최상의 미생물 균주를 선택합니다. 이 방법은 간단하고 실행하기 쉽지만 우수한 균주를 얻을 확률이 낮고 일반적으로 생산 요구를 충족시키기 어렵습니다.

3 인공선택

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돌연변이육종과 잡종육종 두 가지로 나누어진다.

돌연변이 육종

유도된 유전자 돌연변이를 수단으로 이용하는 미생물 육종 기술. 1927년 H.J. 말러(H.J. Mahler)는 그 등)과 화학적 돌연변이 유발 요인을 발견했습니다. 화학적 돌연변이 유발 요인은 세 가지 유형으로 분류됩니다. ① 돌연변이 유발 물질은 하나 이상의 핵산 염기와 화학적으로 변화하여 DNA 복제 중에 염기 치환을 유발합니다. 예: 히드록실아민 아질산염, 디에틸 황산염, 메틸술폰산, 니트로구아니딘, 니트로소메틸우레아 등. ; ② 돌연변이원은 복제 중에 DNA 분자에 통합되어 5-브로모우라실, 5-아미노우라실, 8-아자구아닌 및 2-아미노퓨린 등과 같은 돌연변이를 일으키는 천연 염기의 구조적 유사체입니다. ③ 돌연변이원은 1에서 2로 감소하거나 증가합니다. DNA 분자를 기반으로 하여 염기 돌연변이 지점 아래의 모든 유전 코드의 전사 및 번역에 오류가 발생하여 코드 아크리딘 및 일부 질소 머스타드 유도체(ICR) 등과 같은 그룹 이동 돌연변이가 출현합니다. 돌연변이 육종은 조작이 쉽고 돌연변이율이 높으며 돌연변이 스펙트럼이 넓습니다. 생산량을 늘리고 품질을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 제품 품종을 확대하고 공정 조건을 단순화할 수 있습니다. 예를 들어, 1943년 자연에서 분리된 페니실린 생산 박테리아의 역가는 20단위/ml에 불과했지만, 일련의 돌연변이 번식 후에 클로르테트라사이클린 생산 박테리아의 돌연변이 유발 후, 발효액인 데메틸클로르테트라사이클린의 역가는 40,000단위/ml에 도달했습니다. Corynebacterium 글루타미쿰 1299의 자외선 돌연변이 유발 후 일부는 라이신을 생성하고 일부는 발린을 생성하여 옥시테트라사이클린 생성 세균의 다양성을 증가시켰습니다. 발효기의 활용. 돌연변이 육종의 단점은 방향성이 없다는 것이다.

잡종육종

유전자형이 다른 균주나 종간 교배나 체세포 융합을 통해 교배종을 형성하거나, 형질전환 및 형질도입을 통해 재조합체를 형성한 후 Select Superior에서 재조합체를 형성하는 방법 이들 잡종이나 재조합체 또는 이들의 자손으로부터의 계통. 이 방법을 통해 새로운 유전자 조합을 가진 재조합체를 분리할 수 있으며, 성장이 왕성하고 바이오매스가 크며 적응성이 강하고 잡종 활력으로 인해 특정 효소의 활성이 증가된 새로운 균주를 선별할 수 있습니다. 이종교배 방법은 유성교배, 준유성재조합, 원형질체 융합, 형질전환, 형질도입, 하이브리드 플라스미드 형질전환 등 실험균주의 번식방법에 따라 다르지만, 모균주의 선택, 배양 등은 다양하다. 고립된 집단의 자손 중에서 가장 좋은 것을 선택하고 나쁜 것을 제거하는 과정과 잡종 유전자 분석은 기본적으로 동일합니다. 혼성화 방법은 일반적으로 교배 반응을 통해 계통을 교배하거나 융합하여 잡종을 형성하는 것을 말합니다. 이 방법은 적용 범위가 넓으며 와인, 빵, 약용 및 사료 효모의 육종, Streptomyces 및 Penicillium의 항생제 생산 개선, Aspergillus의 효소 활성 강화에 성공했습니다.

체세포융합은 성적으로 반응하지 않는 계통이나 종 사이의 세포융합과 염색체 재조합을 먼저 효소로 세포벽을 녹인 뒤, 원형질체를 염화칼슘-폴리에틸렌글리콜로 처리해 융합을 촉진하는 것이다. . 하이브리드를 구입하세요. 이 방법은 산업용 미생물 균주의 개량에 긍정적인 역할을 한다.

형질전환과 형질도입은 처음에는 박테리아에 적용되었으며 현재는 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 효모에서 널리 사용되고 있습니다. 재조합 DNA 기술의 개발, 재조합 플라스미드 구축 및 형질전환 시스템의 구축으로 이제는 표적 유전자를 수용 세포에 전달하고 중요한 경제적 가치를 지닌 생물학적 활성 물질(백신, 효소 등)을 생산할 수 있는 균주를 얻는 것이 가능해졌습니다. 등) 넥타이.

미생물은 양조산업, 식품산업, 생물학적 제품산업 등과 매우 밀접한 관련이 있습니다. 미생물의 균주의 품질은 각종 산업제품의 품질과 직결되며, 심지어 사람들의 일상생활의 질에도 영향을 미칩니다. 생명을 유지하기 때문에 고품질, 고수율의 미생물 균주 배양이 필요합니다. 미생물 육종의 목적은 생합성의 대사 경로를 사람들이 원하는 방향으로 유도하거나, 세포 내 유전자의 재조합을 촉진하여 유전적 특성을 최적화하고, 특정 대사산물을 인위적으로 과도하게 축적하여 요구되는 높은 수율, 고품질을 얻는 것입니다. 그리고 낮은 소비 균주. 그 접근법 중 하나로 돌연변이 육종(Mutation Breeding)이 널리 활용되어 왔다. 현재 국내 미생물 육종계는 기존의 물리화학적 요인과 기타 돌연변이 유발 방법을 주로 사용하고 있다. 또한, 원형질체 돌연변이 유발 기술은 효소 제제, 항생제, 아미노산, 비타민 등을 위한 박테리아 균주 육종에 널리 사용되어 왔으며 응용 의의가 큰 많은 결과를 얻었습니다.

4 돌연변이 번식

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1.1 물리적 돌연변이 유발

1.1.1 자외선 조사

자외선 조사는 일반적으로 사용되는 물리적 돌연변이 유발 방법 중 하나이며 미생물 돌연변이를 유도하는 데 매우 유용한 도구입니다. DNA와 RNA의 퓨린과 피리미딘의 최대 흡수 피크는 260nm에 있으므로 260nm의 자외선이 가장 효과적인 치명적인 물질입니다. 자외선의 효과에 대해서는 많은 설명이 있지만 보다 확실한 효과는 DNA 분자가 피리미딘 이량체를 형성하게 한다는 것입니다[1]. 이합체의 형성은 염기 간의 정상적인 짝짓기를 방해하므로 돌연변이나 심지어 사망으로 이어질 수 있습니다[2].

자외선 조사 돌연변이 유발은 조작이 간단하고 경제적이며 일반적인 실험실 조건에서 달성할 수 있으며 양성 돌연변이 발생 확률이 높으며 이 방법은 효모 균주의 돌연변이 유발에 주로 사용됩니다.

1.1.2 이온화 방사선

γ선은 이온화 생물학에서 가장 널리 사용되는 이온화 광선 중 하나이며 높은 에너지를 가지며 직접적으로 사용되거나 이온화될 수 있습니다. DNA 구조를 간접적으로 변경합니다. 직접적인 효과는 디옥시리보스의 염기, 즉 디옥시리보스와 당-인산염 사이의 화학적 결합을 산화시키는 것입니다. 간접적인 효과는 물이나 유기 분자가 자유 라디칼을 생성하도록 할 수 있다는 것입니다. 이러한 자유 라디칼은 세포의 용질 분자와 화학적 변화를 겪어 DNA 구성 요소가 삭제되고 손상될 수 있습니다[2].

전리 방사선에는 γ선 외에도 X선, β선, 고속 중성자가 포함됩니다. 이온화 방사선은 특정 제한 사항, 높은 운영 요구 사항 및 특정 위험을 가지고 있으며 일반적으로 다른 돌연변이 유발 물질을 사용할 수 없는 돌연변이 육종 과정에 사용됩니다.

1.1.3 이온 주입

이온 주입은 1980년대 초반에 등장한 첨단 기술로 주로 금속 재료의 표면을 개질하는 데 사용됩니다. 이는 1986년부터 점차적으로 작물 육종에 활용되어 왔으며, 최근에는 미생물 육종에도 이 기술이 점차 도입되고 있다[3].

이온 주입 중에 생체분자는 에너지를 흡수하고 복잡한 물리적, 화학적 변화를 일으킵니다. 이러한 변화의 중간체는 다양한 유형의 활성 자유 라디칼입니다. 이러한 자유 라디칼은 다른 정상적인 생물학적 분자에 손상을 입히고 세포의 염색체 돌연변이, DNA 사슬 파손, 플라스미드 DNA 파손을 일으킬 수 있습니다. 이온주입 범위를 제어할 수 있으므로 마이크로빔 기술과 정밀 위치결정 기술의 발달로 위치결정 돌연변이 유발이 가능해질 것이다[4].

미생물 돌연변이 육종을 위한 이온 주입 방법은 일반적인 실험실 조건에서는 달성하기 어렵고 현재 상대적으로 거의 사용되지 않습니다.

1.1.4 레이저

레이저는 일종의 빛 양자 흐름으로, 빛 입자라고도 알려져 있습니다. 레이저 방사선은 빛, 열, 압력 및 전자기장 효과의 결합을 통해 유기체에 직간접적으로 영향을 미쳐 세포 염색체 왜곡 효과, 효소 활성화 또는 비활성화, 세포 분열 및 세포 대사 활동의 변화를 일으킬 수 있습니다.

가벼운 양자가 세포 내용물의 어떤 물질에 작용하면 생물학적 유기체의 세포 및 유전적 특성에 변화를 일으킬 수 있습니다. 다양한 유형의 레이저는 생물학적 유기체에 조사되며 다양한 세포학적, 유전적 변화를 나타냅니다[5].

사육방법으로서 레이저는 조작이 간단하고 안전하게 사용할 수 있다는 장점이 있다. 최근 레이저는 미생물 육종에 많은 발전을 이루었다.

1.1.5 마이크로파

마이크로파 방사선은 일종의 저에너지 전자기 방사선입니다. 생물학적 영향이 강한 주파수 범위는 300MHz~300GHz이며 열 및 비열이 있습니다. 살아있는 유기체에 미치는 영향. 열 효과는 유기체의 국소 온도를 상승시킬 수 있음을 의미합니다. 따라서 생리학적 및 생화학적 반응을 일으키는 비열적 효과는 마이크로파의 작용 하에서 유기체가 온도와 관련되지 않은 다양한 생리학적 및 생화학적 반응을 생성한다는 사실을 의미합니다. 이 두 가지 효과가 결합되어 유기체는 일련의 돌연변이 효과를 생성합니다[6].

이렇게 마이크로파는 작물 육종, 동물 육종, 산업 미생물 육종 등 여러 분야에서 돌연변이 육종에도 활용돼 일정한 성과를 거두었다.

1.1.6 우주 육종

우주 돌연변이 육종이라고도 하는 우주 육종은 고고도 풍선, 귀환 가능한 위성, 우주선 및 기타 우주선을 사용하여 작물 종자, 조직을 돌연변이시키는 것입니다. , 장기 또는 살아있는 개체를 우주로 운반하고 우주의 특수한 환경을 이용하여 생물학적 유전자를 변이시킨 후 지상으로 돌아와 선택적 육종 및 신작물 육종 기술을 통해 신품종 및 신소재를 개발합니다. 우주 환경 요인에는 주로 미세 중력, 우주 방사선 및 교번 자기장, 초진공 환경 등과 같은 기타 돌연변이 유발 요인이 포함됩니다. 이러한 요인의 상호 작용은 생물학적 시스템에 유전적 손상을 유발하여 유기체가 돌연변이, 염색체 이상 및 세포를 겪게 합니다. 비활성화, 발달 이상 등.

항공우주육종은 다른 육종방법에 비해 특수한데, 이는 항공우주기술과 미생물 육종기술이 유기적으로 결합된 기술로서 개인연구자나 일반연구단위에서는 달성하기 어려운 기술이다. 그것은 항공우주기술과만 결합될 수 있다. 결합은 국가에 의해 이루어진다.

1.1.7 대기 및 실온 플라즈마 돌연변이 번식

ARTP(대기 및 실온 플라즈마)는 대기압 하에서 25도의 온도를 생성하는 능력을 말합니다. -40 °C 사이의 고농도 활성 입자(여기 상태의 헬륨 원자, 산소 원자, 질소 원자, OH 라디칼 등 포함)를 포함하는 플라즈마 제트입니다. 새로운 물리적 방법인 ARTP 기술은 미생물 돌연변이 육종 분야에서 폭넓은 응용 가능성을 가지고 있습니다.

혈장 내 활성입자를 적정량 투여하면 미생물에 작용해 미생물 세포벽/막의 구조와 투과성을 변화시켜 유전적 손상을 일으킬 수 있다. 미생물은 3ˊ 엑소뉴클레아제의 교정 기능이 없는 DNA 중합효소 IV와 V의 생성을 유도하는 SOS 복구 메커니즘을 시작하므로 DNA 사슬의 손상된 부위에 짝을 이루지 않은 염기가 나타나더라도 복제가 계속 진행될 수 있습니다. 이 상황에서 불일치를 허용하면 생존 가능성이 높아집니다. ARTP에 의한 유전물질의 손상은 매우 다양하며 SOS로 인한 복구 자체는 내결함성 복구이므로 미생물이 수행하는 과정에서 ARTP의 다양성으로 인한 손상이 DNA 사슬에 포함될 수 있습니다. 복제 및 수리, 다양성을 가져올 수 있는 불일치 가능성.

ARTP는 미생물 돌연변이 육종에 사용되며, 비용이 저렴하고 조작이 용이하며, 많은 물리적 돌연변이 유발 장비에서 요구되는 이온 또는 전자 가속, 진공 및 냉장 등의 보조 장비가 필요하지 않습니다. 이온빔 주입 등)에 적합합니다. 유전물질은 다양한 손상 메커니즘을 갖고 있으며 양성 돌연변이율이 높으며 다양한 돌연변이 특성을 가지고 있어 곰팡이, 박테리아, 조류 등에 대한 오염이 없습니다. 환경을 보호하고 작업자의 개인 안전을 보장합니다. 어떤 종류의 가스를 사용하더라도 유해한 가스가 발생하지 않습니다. [1]

5 화학적 돌연변이 유발

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2.1.1 알킬화제

알킬화제는 하나 이상의 A 핵산과 상호작용할 수 있습니다. 산염기 반응은 DNA 복제 중 염기쌍 전환으로 인해 유전적 변이를 일으킵니다. 일반적으로 사용되는 알킬화제에는 에틸 메탄술포네이트, 니트로소구아니딘, 에틸렌이민, 디에틸 황산염 등이 있습니다.

EMS(에틸메탄 술포네이트)는 가장 일반적으로 사용되는 알킬화제이며 돌연변이 발생률이 높습니다.

이에 의해 유발된 돌연변이 균주는 대부분 점돌연변이로 발암성이 높고 휘발성이 높으며 5% 티오황산나트륨은 종결제 및 해독제로 사용할 수 있다.

N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)은 널리 사용되는 슈퍼뮤타젠(supermutagen)이지만, 일정한 독성을 갖고 있어 수술 시 주의가 필요하다. 알칼리성 조건에서 NTG는 치사율과 돌연변이 유발의 주요 원인인 디아조메탄(CH2N2)을 형성합니다. 그 효과는 아마도 CH2N2에 의한 DNA의 알킬화에 의해 발생하는 것 같습니다[2].

황산다이에틸(DMS)도 흔히 사용되지만 독성이 강해 거의 사용되지 않습니다. 에틸렌이민은 소량 생산되기 때문에 구매가 어렵습니다. 사용농도는 0.0001%~0.1%로 발암성이 매우 높으므로 사용시 완충용액이 필요합니다.

2.1.2 염기 유사체

염기 유사체의 분자 구조는 천연 염기와 유사하며 DNA 분자에 통합되어 DNA 복제 및 무질서한 mRNA 전사 중에 불일치를 일으킬 수 있습니다. 단백질 재조합 및 표현형 변화. 이런 종류의 물질은 상대적으로 독성이 덜하지만 음성 돌연변이 발생률이 높고 좋은 돌연변이를 얻기 어려운 경우가 많습니다. 주요한 것에는 5-플루오로우라실(5-FU), 5-브로모우라실(5-BU), 6-클로로퓨린 등이 포함됩니다. Cheng Shiqing 등[25]은 색소 생성 박테리아(Mycobacterium T17-2-39)의 세포를 돌연변이 유발하기 위해 5-BU를 사용했으며, 바이오매스는 평균 22.5% 증가했습니다.

2.1.3 무기 화합물

돌연변이 유발 효과는 보통 수준이며 위험도는 낮습니다. 일반적으로 사용되는 염화리튬은 백색결정으로 사용시 0.1%~0.5% 용액에 혼합하거나 돌연변이 유발 고체배지에 직접 첨가할 수 있으며 작용시간은 30분~2일이다. 아질산은 분해되기 쉽기 때문에 바로 사용할 수 있습니다. 일반적으로 아질산나트륨과 염산으로 제조되며, 아질산나트륨을 0.01~0.1mol/L의 농도로 준비하며, 사용할 경우에는 동일한 농도와 부피의 염산을 첨가합니다.

2.1.4 기타

환원제인 히드록실아민 염산염은 C에 작용하여 G-C를 A-T로 변화시킵니다. 또한 일반적으로 사용되며 농도는 0.1%~0.5%, 작용시간은 60분~2시간이다.

또한 돌연변이 유발을 시행할 때에는 두 가지 이상의 돌연변이 유발 인자를 조합하여 사용하거나, 동일한 돌연변이 유발 인자를 반복적으로 사용하여 더 나은 결과를 얻을 수 있다. Gu Zhenghua 등[7]은 Corynebacterium 글루타미쿰 ATCC-13761을 출발 균주로 사용하였고, DMS와 NTG를 이용한 다중 돌연변이 처리를 통해 L-히스티딘 생산 균주를 얻었다.

2. 돌연변이원

2.1 돌연변이원의 선택

돌연변이원제를 선택할 때에는 돌연변이원의 특이성에 주의할 필요가 있다. 돌연변이 유발 또는 돌연변이 유발 치료는 게놈의 특정 부분에 우선적으로 돌연변이를 일으키고 다른 부분에는 돌연변이를 거의 일으키지 않습니다. 돌연변이 유발원 특이성의 분자적 기반은 잘 알려져 있지 않습니다. 관련 복구 경로가 이에 영향을 미치기는 하지만, 돌연변이 유발 치료의 환경 조건을 포함한 다양한 다른 요인도 돌연변이 유형에 영향을 미칠 수 있습니다. .

산업 유전학자들이 특정 박테리아 종을 개선하기 위해 어떤 유형의 분자 수준 돌연변이가 필요할지 정확하게 예측하기는 어렵습니다. 따라서 가능한 한 많은 유형의 돌연변이를 생성하기 위해 가장 적절한 접근법은 여러 가지 보완적인 유형의 돌연변이 유발 치료법을 사용하는 것입니다. 원적외선(Far UV)은 의심할 여지 없이 모든 돌연변이 유발물질 중에서 가장 적합하며 알려진 모든 유형의 손상을 유발하는 것으로 보입니다. 효과적이고 안전한 예방 방법을 취하는 것도 쉽습니다. 화학적 돌연변이 유발물질 중 액체 시약은 분말 시약보다 안전하게 취급하기가 더 쉽습니다. 또 다른 단점은 밀접하게 연결된 돌연변이 클러스터를 생성하는 경향이 있다는 것입니다. 그러나 이 효과는 일부 시스템에서 이점이 될 수 있습니다. 마지막으로, 특정 박테리아 종은 특정 돌연변이 유발원으로 인해 돌연변이가 발생하지 않을 수 있다는 점을 인식해야 합니다. 물론 이는 약물 저항성 돌연변이나 원영양 복귀제와 같이 쉽게 감지할 수 있는 돌연변이의 돌연변이 유발 동역학을 측정하여 상당히 쉽게 확인할 수 있습니다. [8]

2.2 돌연변이 유발물질의 투여량

무작위 선별의 가장 좋은 효과라는 관점에서 볼 때 최적의 돌연변이 유발물질 투여량은 생존 집단 중 가장 높은 값을 얻는 것입니다. 원하는 돌연변이의 비율을 스크리닝하면 역가 결정 단계가 덜 힘들어집니다.

따라서 균주 개선에 앞서 사용할 돌연변이원의 최적 용량을 결정하고 돌연변이 유발 강화 기술의 기반을 마련하기 위해 일반적으로 다양한 돌연변이원이 다양한 박테리아 균주에 미치는 영향을 측정하는 것이 현명한 접근 방식입니다. . 돌연변이 역학.

높은 단위의 돌연변이 자체를 이용하여 최적의 용량을 결정하는 것은 이러한 돌연변이의 검출이 어렵기 때문에 때로는 불가능합니다. 그러나 약물 내성 마커와 같이 검출하기 쉬운 마커를 사용하는 경우 방법의 한계를 추정하는 한 여전히 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.