1. 목표유전자는 단백질을 인코딩하는 구조유전자를 가리킨다.
2. 원핵 유전자는 직접 분리되고 진핵 유전자는 인위적으로 합성된다. 합성 목적 유전자에 일반적으로 사용되는 방법은 역전사법과 화학합성법이다.
목적 유전자의 PCR 증폭
원리 (1): DNA 이중 가닥 복제
(2) 프로세스:
첫 번째 단계: 90 ~ 95 ℃로 가열하여 DNA 를 녹인다.
단계 (2): 55-60 C 로 냉각하고 프라이머를 보완 DNA 체인에 결합합니다.
단계 (3): 70 ~ 75 C 로 가열하고, 열적으로 안정된 DNA 중합 효소로 프라이머에서 상보성 체인을 합성한다.
두 번째 단계: 유전자 발현 벡터의 구축.
1. 목적: 목적 유전자가 수용체 세포에 안정적으로 존재하고 다음 세대에게 유전되어 목적 유전자가 표현되고 작용할 수 있도록 한다.
구성: 목적 유전자+프로모터+종료자+마커 유전자.
프로모터 (1) 는 유전자의 머리에 위치한 특수한 구조를 가진 DNA 조각으로, RNA 중합효소가 결합을 인식하고 유전자 전사 mRNA 를 구동하여 결국 필요한 단백질을 얻을 수 있다.
(2) 터미네이터: 유전자의 끝에 위치한 특별한 구조를 가진 DNA 조각이기도 합니다.
(3) 표지유전자의 역할은 수용체 세포가 목적유전자를 함유하고 있는지 여부를 판별하여 목적유전자를 함유한 세포를 선별하는 것이다. 일반적으로 사용되는 표지 유전자는 항생제 유전자이다.
3 단계: 수용체 세포에 표적 유전자 도입
1. 변화의 개념:
그것은 목적 유전자가 수용체 세포에 들어가 수용체 세포에서 안정된 표현을 유지하는 과정이다.
2. 일반적인 변환 방법:
목적유전자를 식물세포에 도입한다. 농균전환은 가장 많이 쓰이는 방법이고, 그 다음은 입자폭격과 화분관 통로법이다.
목적 유전자를 동물세포에 도입한다. 가장 많이 사용하는 방법은 현미주사 기술이다. 이 방법의 수용체 세포는 대부분 수정란이다.
목적 유전자를 미생물 세포에 도입한다. 원핵 생물은 번식이 빠르고 세포가 단일하며 유전물질이 상대적으로 적기 때문에 수용체 세포로 사용된다. 가장 일반적으로 사용되는 원핵 세포는 대장균이다. 변환 방법은 먼저 Ca2+ 로 세포를 처리하여 감각 세포로 만든 다음 재조합 발현 벡터 DNA 분자를 완충액에 용해시켜 감각 세포와 혼합함으로써 감각 세포가 특정 온도에서 DNA 분자를 흡수하도록 하는 것이다. 변환 과정을 완료합니다.
3. 재조합 세포가 수용체 세포에 도입 된 후, 유전자 발현 벡터를 함유 한 수용체 세포를 스크리닝하는 근거는 유전자 발현 여부를 표시하는 것이다.
4 단계: 표적 유전자의 검출 및 발현.
1. 우선, DNA 분자 잡교 기술을 이용하여 대상 유전자가 유전자 변형 생물체의 염색체 DNA 에 삽입되는지 여부를 검사해야 한다.
2. 둘째, 표기된 목적유전자를 프로브로 사용하여 mRNA 와 교잡함으로써 목적유전자에 전사된 mRNA 가 있는지 여부를 검사해야 한다.
3. 마지막으로, 유전자 변형 생물체에서 단백질을 추출하고, 해당 항체 (GM) 과 항원 항체 교잡하여, 목적유전자가 단백질로 번역되는지 여부를 검사한다.
때로는 개인의 생물학적 수준을 확인해야합니다. 예를 들어, 형질 전환 곤충 저항성 식물이 곤충 저항성 특성을 가지고 있는지 여부.
"분자 메스"-제한된 핵산 엔도 뉴 클레아 제 (제한적 엔도 뉴 클레아 제)
(1) 출처:
주로 원핵 생물에서 분리 순화하다.
(2) 기능:
그것은 이중 가닥 DNA 분자의 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하고, 각 사슬의 특정 부위 두 뉴클레오티드 사이의 인산이 에스테르 결합을 끊어 특이성을 가지고 있다.
(3) 결과:
제한적인 내체 효소 절단으로 인한 DNA 조각의 끝은 일반적으로 접착과 끝단의 두 가지 형태가 있다.
"분자 봉합 바늘"-DNA 연결 효소
(1) 두 개의 DNA 연결 효소 (e? 대장 DNA 연결 효소 및 T4-DNA 연결 효소);
① 유사성: 인산이 에스테르 결합 봉합이다.
② 차이:
E? 대장균 DNA 연결 효소는 T4 파지에서 유래한 것으로, 쌍체인 DNA 조각의 상보성 점성 끝 사이에 있는 인산다이에스테르 결합만 연결할 수 있다. T4DNA 연결 효소는 두 끝을 봉합할 수 있지만 평평한 끝을 연결하는 것은 비효율적이다.
(2) DNA 중합 효소와의 유사점과 차이점:
DNA 중합 효소는 기존의 뉴클레오티드 단편의 끝에 뉴클레오티드를 추가하여 인산이 에스테르 결합을 형성할 수 있다. DNA 연결 효소는 두 개의 DNA 조각의 끝을 연결하여 인산이 에스테르 결합을 형성한다.
"분자 운송 수단"-캐리어
(1) 캐리어 조건:
① 수용체 세포에서 복제하고 안정적으로 보존할 수 있다.
② 하나 이상의 제한 효소 접점이 있어 외원 DNA 조각을 삽입하는 데 사용됩니다.
③ 재조합 DNA 마커 유전자를 식별하고 선택한다.
(2) 가장 일반적으로 사용되는 캐리어는 무엇입니까? 플라스미드는 노출, 간단한 구조, 세균 염색체에 의존하지 않고 자기 복제 능력을 가진 이중 사슬 고리 DNA 분자이다.
(3) 기타 전달체: 파지, 동식물 바이러스의 유도물.
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