그러나 현재 DNA 시퀀싱은 여전히 Sanger 의 원리에 의존하고 있지만 형광 염료와 결합하여 감도를 높인다고 말하고 싶습니다.
DNA 시퀀싱의 원리와 방법
DNA 시퀀싱은 인공 시퀀싱과 자동 시퀀싱으로 나눌 수 있습니다. 수작업 서열분석에는 산그 쌍탈산사슬 종료법과 무극생 조합인 길버트 화학분해법이 포함된다. 자동 시퀀싱은 실제로 DNA 서열 분석의 주류가 되었다. 미국 PE ABI 는 373, 377, 3 10, 3700 및 3 100 DNA 시퀀서를 생산했으며, 여기서 3 10 은 임상 검사 실험실에서 가장 널리 사용되는 모델입니다. 본 실험은 ABI PRISM 3 10 DNA 시퀀서의 시퀀싱 원리와 조작 절차를 소개했다.
원리 ABI PRISM 3 10 유전자 분석기 (DNA 시퀀서) 는 기존의 폴리아크릴 플레이트 전기 수영 대신 모세관 전기 수영 기술을 사용하며, 회사 특허 4 색 형광 염료로 표시된 ddNTP (표시 종료자 방법) 를 사용하기 때문에 단일 프라이머 PCR 시퀀싱 반응을 통해 생성된 PCR 제품은 3'' 입니다 차이 1 염기, 이렇게 네 가지 형광 염료의 시퀀싱 PCR 산물은 모세관에서 전기 영동할 수 있어 레인과 간 이동률 차이의 영향을 피할 수 있다. 분자 크기가 다르기 때문에 모세관 전기 영동의 유동성도 다르다. 분자가 모세관 판독 창을 통과할 때 레이저 탐지기 창의 CCD (전하 커플러) 카메라 탐지기는 형광 분자를 하나씩 감지할 수 있습니다. 여기 형광은 래스터에 의해 분할되어 서로 다른 기본 정보를 나타내는 서로 다른 색상의 형광을 구분하고 CCD 카메라에서 이미지를 동기화합니다. 분석 소프트웨어는 서로 다른 형광을 DNA 서열로 자동 변환하여 DNA 시퀀싱의 목적을 달성할 수 있다. 분석 결과는 젤 전기 영동지도, 형광 흡수봉도, 염기서열 등 다양한 형식으로 출력할 수 있다.
자동 포팅, 자동 샘플링, 자동 데이터 수집 및 분석과 같은 컴퓨터 자동 제어로 DNA 조각의 염기서열, 크기 및 정량을 측정하는 고급 정밀 기기입니다. PE 는 DNA 시퀀싱 젤 (POP 6) 과 GeneScan 젤 (POP 4) 을 포함한 젤 중합체도 제공합니다. 이 젤 알갱이들은 구멍 지름의 크기가 균일하여 젤 준비 조건이 일치하지 않아 시퀀싱의 정확성에 미치는 영향을 피한다. 주로 모세관 전기 영동 장치, Macintosh 컴퓨터, 컬러 프린터 및 전기 영동 액세서리로 구성됩니다. 컴퓨터에는 데이터 수집, 분석 및 기기 작동을 위한 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 최신 CCD 카메라 탐지기를 사용하여 DNA 시퀀싱을 2.5h 로 줄이고 PCR 세그먼트 크기 분석 및 정량 분석을 10 ~ 40 분으로 줄입니다.
기기는 DNA 시퀀싱, PCR 세그먼트 크기 분석 및 정량 분석 기능을 갖추고 있어 DNA 시퀀싱, 잡합 분석, 단일 체인 구조 다형성 분석 (SSCP), 마이크로위성 시퀀스 분석, 긴 세그먼트 PCR, RT-PCR (정량 PCR) 등의 분석을 수행할 수 있습니다. 일반적인 DNA 시퀀싱 외에도 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 유전자 돌연변이 검출, HLA 배합형 및 법의학을 수행할 수 있습니다.
시약 및 장비
1 의 주 시약. Big Dye 시퀀싱 반응 테스트 키트 BigDye Mix, 4 색 형광 마크가 포함된 ddNTP 및 PE 특허의 일반 dNTP, AmpliTaq DNA 중합 효소 FS, 반응 완충액 등.
Pgem-3zf (+) 이중 가닥 DNA 제어 템플릿 0.2g/L, 테스트 키트 지원 시약.
3.M 13 (-2 1) 인용 TGTAAAACGACGGCCAGT, 3.2μmol/L, 즉 3.2pmol/μl, 테스트 키트
4.DNA 시퀀싱 템플릿은 PCR 제품, 단일 체인 DNA 및 플라스미드 DNA 일 수 있습니다. 템플릿 농도를 조정하려면 PCR 반응 1μl 이 적당하다. 본 실험에서 측정한 플라스미드 DNA 농도는 0.2g/L, 즉 200 ng/μ L 입니다 .....
5. 프라이머는 테스트할 DNA 단편에 따라 순방향 또는 역방향 프라이머를 설계하고 3.2μmol/L, 즉 3.2 pmol/μ L 을 준비해야 합니다. 재조합 플라스미드에 공통 프라이머 시퀀스가 포함되어 있는 경우 M13 (-2/
탈 이온수 또는 삼중 증류수 소독.
7.0.2ml 또는 0.5ml PCR 덮개, PE 회사 제품에서 분리.
8.3 mol/L 아세트산 나트륨 (pH5.2) 은 40.8g NaAc·3H2O 를 70ml 증류수에 녹여 빙초산으로 pH 를 5.2 로 조절하고 100ml 로 정하여 고압 멸균 후 포장한다고 합니다.
에탄올 9.70% 와 절대 에탄올.
10. 37.5ml 의 무수에탄올과 2.5ml 3 무어/리터 초산나트륨을 혼합함으로써 NaAc 에탄올 혼합물은 실온에서 65438 0 년을 저장할 수 있다.
1 1.pop6 시퀀싱 젤 ABI 제품.
12. 템플릿 억제제 (TSR) ABI 제품.
13. 10× 전기 영동 버퍼 ABI 제품.
14.ABI Prism3 10 자동 DNA 시퀀서.
15.2400 또는 9600 PCR 기기.
16. 데스크탑 냉동 고속 원심 분리기.
17. 데스크탑 고속 원심분리기 또는 포켓 원심분리기.
조작 절차
1.PCR 시퀀싱 반응
(1) 0.2ml 의 PCR 시험관을 가져와서 표기법으로 번호를 매기고 시험관을 입상 얼음에 삽입하고 아래 표에 따라 시약 추가:
시약 추가 템플릿 파이프를 측정하는 표준 제어 파이프
BigDye 혼합물 1 마이크로 리터 1 마이크로 리터
플라스미드 DNA 1 μ L-
PGEM-3Zf (+) 이중 가닥 DNA- 1 μ l
순방향 프라이머 1 μ L-
M 13(-2 1) 프라이머-1μ l
무균 탈 이온수 2 마이크로 리터 2 마이크로 리터
총 반응 볼륨 5μl, 경량 광유나 파라핀 오일 없음, PCR 튜브 덮개 고정, 손가락 탄성관으로 섞여서 약간 원심합니다.
(2) PCR 파이프를 9600 또는 2400 PCR 기기에 올려 증폭한다. 98℃ 변성 2 분 후, PCR 주기. PCR 주기 매개변수는 96 C10S, 50℃ 5s, 60 C 4 분, 25 사이클입니다. 증폭 후 온도는 4 ℃로 설정됩니다.
아세트산 나트륨/에탄올 법에 의한 PCR 제품의 정제.
(1) 원심 혼합물 및 증폭 생성물을 1.5ml EP 튜브에 전달.
(2) 25μl 아세트산 나트륨/에탄올 혼합 용액을 넣고 충분히 흔들어 얼음 위에 65438±00min 침전 DNA 를 넣는다. 4 C 에서 12000 회전/분 원심 30 분 동안 상청액을 조심해서 버리세요.
(3) 50μl 70%(V/V) 의 에탄올 세척 침전물을 두 번 넣는다. 4 C 에서 12 000r/min 원심 5min 으로 튜브 벽의 상청액과 액체 구슬, 진공 건조 침전 10 ~ 15min 을 조심스럽게 폐기합니다.
전기 영동 전 시퀀싱 PCR 제품 처리.
(1) 원심관에 12μl TSR 을 넣고 심하게 흔들어 DNA 침전을 충분히 용해시키고 경미하게 원심합니다.
(2) 용액을 0.2ml PCR 관으로 옮기고 뚜껑을 열고 약간 원심합니다.
(3) PCR 계기에서 열변성 (95 C 2 분) 을 한 다음 얼음에서 담금질한다.
4. 기기의 작동 지침에 따라 모세관을 설치하고, 모세관의 위치를 교정하고, 수동으로 관개하고, 시퀀싱 시퀀스 파일을 작성합니다. 기기는 자동으로 접착제를 모세관에 주입한다. 65 분 438+0.2kV 사전 전기 수영 5 분, 프로그래밍 순서에 따라 자동 샘플, 65 분 438+0.2kV 사전 전기 수영 20 분, 7.5kV 전기 수영 2 시간. 전기 수영이 끝나면 기기는 자동으로 세척하고, 접착제를 붓고, 다음 샘플, 사전 전기 수영, 전기 영동으로 들어간다. 각 샘플의 총 전기 수영 시간은 2.5h 이며, 전기 영동이 끝나면 기기는 자동으로 컬러 시퀀싱지도를 분석하거나 인쇄합니다.
5. 기기는 자동으로 시퀀스 분석을 수행하고 사용자 요구 사항에 따라 시퀀스 비교를 수행할 수 있습니다. 시퀀싱 순서가 알려진 경우 시퀀스 비교를 통해 서로 다른 염기를 별표로 표시하여 생산성을 높일 수 있습니다.
6. 시퀀싱 후 기기의 작동 규칙에 따라 기기를 청소하고 유지한다.
계산
시퀀싱 반응 정확도는 100%- 차이 염기수 (N 수 제외) /650× 100% 로 계산됩니다.
차등 염기는 확정된 DNA 서열이 알려진 표준 DNA 서열과 다른 염기를 가리키며, N 은 기기가 읽을 수 없는 염기이다.
주의사항 및 평가
1.ABI prism 3 10 유전자 분석기는 전문적인 조작, 관리 및 유지 보수가 필요한 고급 정밀 기기입니다.
2. 본 실험에서 PCR 반응의 총 부피는 5μl 이며 광유로 덮지 않았기 때문에 PCR 튜브 덮개의 밀봉이 중요하다. 시약 추가 후 PCR 뚜껑을 닫는 것 외에 PE 사의 PCR 파이프를 사용하는 것이 좋습니다. PCR 후 PCR 액이 4 ~ 4.5 μ l 미만이면 PCR 반응이 실패할 수 있으며 순화와 상형이 필요하지 않습니다.
3. 시퀀싱 사용자로서 순화된 DNA 샘플과 프라이머만 제공하면 됩니다. 염기서열 PCR 반응에 다른 템플릿을 사용하기 때문에 필요한 DNA 의 양은 다르다. PCR 시퀀싱에 필요한 템플릿 수가 적고, 일반 PCR 산물은 30-90 ng, 단일 체인 DNA 는 50- 100 ng, 이중 체인 DNA 는 200-500 ng, DNA 순도는 일반적으로 A 260 nm/a 로 이온을 제거합니다
4. 본 실험에서 사용하는 시퀀싱 테스트 키트 BigDye 형광 마크 종료 기질 순환 시퀀싱 테스트 키트, 일반적으로 측정할 수 있는 DNA 길이는 약 650bp 입니다. 본 기기의 DNA 시퀀싱의 정확도는 (98.5 0.5)% 이며, 본 기구가 읽을 수 없는 염기수는 2% 미만이다. 테스트할 길이가 650bp 를 초과하는 경우 다른 프라이머를 설계해야 합니다. 시퀀싱이 더 정확한지 확인하기 위해 역방향 프라이머를 설계하여 동일한 템플릿을 시퀀싱하고 서로 검증할 수 있습니다. N 염기는 수동으로 검사할 수 있고, 때로는 읽을 수 있다. 시퀀싱의 정확성을 높이기 위해 별표로 표시된 위치에 따라 컬러 맵을 수동으로 분석하여 염기를 추가로 검사할 수 있다.