제한 핵산 내체효소: 특정 쌍사슬 DNA 서열을 식별하고 절단하는 핵산 내체효소입니다.

[별칭] 디옥시리보 핵산 효소

[효소 반응] 제한 내체효소는 한정된 수의 특정 지점에서 DNA 분자를 분열시킬 수 있다. 외래 DNA 를 인식하고 분해합니다.

[단위 정의] 지시된 pH 와 37 C 에서 0.05mL 반응 혼합물에서 소화 1 μ G DNA1시간의 효소량은1단위입니다.

"특성" 제품에는 비특이적 핵산 가수 분해 효소 (10 단위 내체효소와1μ G DNA 부화 16 시간 후에 얻은 겔 전기 영동지도의 안정성) 가 포함되어 있지 않다.

제한적인 핵산 엔도 뉴 클레아 제의 명명; 일반적으로 이름의 첫 글자와 종명의 처음 두 글자로 구성되며, 네 번째 글자는 품계 (품계) 를 나타낸다. 예를 들어, 녹말 포자균 H 에서 추출한 제한적인 내체효소를 Bam H 라고 하며, 같은 세균에서 얻은 여러 염기서열을 식별하는 몇 가지 특이성이 다른 효소는 HINDI, HindIII, HpaI, HPAI, HpaII, MboI, MboI 등으로 인코딩될 수 있습니다.

생물의 체내에는 외원 DNA 를 차단할 수 있는 효소가 있는데, 이는 외원 DNA 의 침입을 제한하여 활력을 잃게 하지만 자신의 DNA 에 손상이 없어 세포의 원래 유전 정보를 보호할 수 있다. 이 절단은 DNA 분자 내부에서 이루어지기 때문에 제한적인 내체효소 (제한적인 내체효소) 라고 불린다. 제한적인 내체 효소는 유전 공학에서 중요한 절단 도구이다. 과학자들은 원핵 생물에서 다양한 제한 내체 효소를 분리해 상용화하여 유전자 공학에 광범위하게 응용했다. 제한 내체 효소 절단의 특징에 따라 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 하나는 절단 부위가 특이하지 않다는 것입니다. 다른 하나는 뉴클레오티드 서열이 특이적으로 인식될 수 있다는 것이다. 즉, 하나의 DNA 서열에서만 절단할 수 있다는 것이다. 특이성에 의해 인식될 수 있는 모든 절단 지점에는 회문 시퀀스가 있습니다. 즉, 절단 지점에서 한 체인이 정방향으로 읽는 염기서열은 다른 체인이 역방향으로 읽는 염기서열과 정확히 같습니다. 후자의 효소는 주로 유전공학에 쓰인다. 제한 내체 효소는 특정 절단 지점에서 절단할 때 절단 방법에 따라 오차 절단과 절단으로 나눌 수 있습니다. 비트 오류 해석은 일반적으로 두 체인의 다른 부분에서 절단되는데, 이들 사이에는 몇 개의 뉴클레오티드가 있다. 절단 후 양쪽 끝에 회문 단일 체인 끝이 형성되어 상호 보완적인 염기와 목적 유전자의 DNA 조각을 연결할 수 있어 점성 끝단이라고 합니다. 이 효소는 유전자 공학에 가장 많이 사용된다. 다른 하나는 두 체인의 특정 시퀀스의 동일한 부분을 잘라서 끈적거리지 않는 평평한 입구를 형성하는 것이다.

유전자 조작 과정에서 제한적인 내체효소 외에 일련의 효소가 전체 과정을 완성해야 한다. 알칼리성 인산 가수 분해 효소, DNA 중합 효소, 말단 전이 효소, 폴리 뉴클레오티드 효소, 역전사 효소 등이 있습니다. 이 효소들은 모두 자신의 특수한 촉매 기능을 가지고 있으며, 현재 모두 판매되고 있으며, 서로 다른 수요에 따라 선택할 수 있다.

간단한 정의:

DNA 제한 핵산 엔도 뉴 클레아 제:

유기체의 특정 쌍사슬 DNA 서열을 식별하고 분해하는 핵산 내체효소. 외원 DNA 를 차단할 수 있는 효소로, 외원 DNA 의 침입을 제한하여 활력을 잃게 하지만 자신의 DNA 에 손상이 없어 세포의 원래 유전 정보를 보호합니다. 이 절단은 DNA 분자 내부에서 이루어지기 때문에 제한적인 내체효소 (제한적인 내체효소) 라고 불린다.

제한 핵산 엔도 뉴 클레아 제 검토

(제한적 핵산 엔도 뉴 클레아 제: 개요)

30 여 년 전, 사람들이 파지의 숙주 특이성 제한 수정 현상을 연구하고 있을 때 제한적인 내체효소가 처음으로 발견되었다. 세균은 새로운 바이러스의 침입에 저항할 수 있는데, 이런' 제한' 바이러스의 생존 방법은 세포 내부의 제한적인 내체효소로 귀결되어 외원 DNA 를 파괴할 수 있다. 발견된 첫 번째 제한 내핵산효소는 대장균의 EcoR I 와 EcoR II, 인플루엔자 혈균에서 온 Hind II 와 Hind III 를 포함한다. 이 효소들은 특정 부위에서 DNA 를 잘라서 체외에서 연결할 수 있는 유전자 조각을 만들 수 있다. 연구원들은 핵산 내체효소가 유전자 구성, 기능, 표현을 연구하는 데 매우 유용한 도구라는 것을 곧 발견했다.

70 년대 제한 내체효소의 응용이 보편화되면서 NEB 를 대표하는 많은 회사들이 더 많은 제한 내체효소를 찾기 시작했다. 일부 바이러스를 제외하고 제한적인 내체 효소는 원핵 생물에만 존재한다. 사람들은 수천 마리의 세균과 고세균 중에서 새로운 제한 내체효소를 찾고 있다. 시퀀싱된 원핵 생물 게놈 데이터에 대한 분석에 따르면, 제한적인 내체 핵산효소는 원핵 생물에서 널리 퍼져 있습니다. 즉, 자유롭게 사는 모든 박테리아와 고균은 제한적인 내체 핵산효소를 코딩할 수 있는 것 같습니다.

제한 내체효소는 Pvu II( 157 아미노산) 또는 Cje I 의 1250 아미노산까지 다양한 형태로 제공됩니다. 정제되고 분류된 3000 여 종의 제한 내체효소에서 250 여 종의 특이성 인식 서열이 발견됐다. 이 중 30% 는 NEB 에서 발견되었으며, 특이성 인식 서열을 알 수 없는 제한적인 내체효소에 대한 연구는 계속되고 있다. 동시에, 사람들은 더 많은 발견을 할 수 있도록 컴퓨터를 이용하여 알려진 게놈 데이터를 분석한다. 새로 발견된 많은 효소의 인식 서열이 기존의 순합효소와 중복되기는 하지만, 효소 식별의 새로운 부위가 있다.

1980 년대에 NEB 는 제한적인 내체효소를 복제하고 표현하기 시작했다. 복제 기술은 제한 내체효소의 표현을 원시 세포 환경과 분리시켜 원시 세포의 다른 내체효소의 오염을 방지함으로써 효소의 순도를 높인다. 또한 복제 기술은 제한적인 내체 효소의 생산량을 높이고 순화 과정을 간소화하며 생산 비용을 크게 절감했습니다. 복제 된 유전자는 시퀀싱과 분석에 매우 쉽고, 표현 된 단백질은 X 선 결정화에 의해 분석 될 수 있으므로 복제 된 제품을보다 확실하게 만들 수 있습니다.

제한적인 핵산 엔도 뉴 클레아 제 I 제한 및 변형

1. 제한 및 수정 현상

일찍이 1950 년대 초, 많은 학자들은 제한과 수정 현상을 발견했는데, 당시에는 숙주 통제 특이성이라고 불렸다. L 파지의 현상은 대표성과 보편성을 가지고 있으며, 다른 숙주 중의 형질 감염 빈도는 이 문제를 설명할 수 있다 (표 2- 1). L 숙주 감염 후 다른 숙주 감염으로 제한된다.

대장균 λ 파지의 감염률

LK lB lC

대장균 k110-410-4

대장균 b10-4110-4

대장균 C 1 1 1

설명 K 와 B 균주에는 외원 DNA 를 배제할 수 있는 제한 시스템이 있다. 10-4 의 생존율은 숙주 수정 시스템의 결과이며 제한 시스템이 아직 작동하지 않았다. 그러나 균주 C 에서는 균주 K 와 B 의 DNA 를 제한할 수 없습니다. 제한은 실제로 보호 메커니즘으로, 효소 대외원 DNA 의 분해를 제한하고 숙주 유전적 안정성을 유지한다. 메틸화는 아데닌 A 를 N6 메틸 아데닌으로, 시토신 C 를 5' 메틸라민' 으로 만드는 흔한 수식이다. 메틸화를 통해 우리는 자신의 유전물질과 외래의 유전물질을 식별할 수 있다.

효소 발견을 제한하십시오.

1960 년대에 사람들은 DNA 가 숙주 감염 후 분해될 수 있다는 것을 알아차렸고, 이로 인해 제한적인 내체효소와 제한적인 내체효소의 개념이 제기되었다. 1968 에서 처음으로 대장균 K 에서 제한효소를 분리했다. 그것에는 특정 한 인식 점이 있다, 그러나 특정 한 절단 점이 없다, 절단 위치는 1000bp 보다는 더 멀리 인식 위치에 있다.

1970 년, 미국 존 홉킨스 대학의 H. Smith 는 인플루엔자혈균이 외원파지 DNA 를 빠르게 분해할 수 있다는 것을 우연히 발견했고, 그 세포 추출액은 대장균 DNA 를 분해할 수 있지만 자신의 DNA 를 분해할 수는 없어 Hind 제한 내체효소를 찾았다. Hind 제한 엔도 뉴 클레아 제 부위 및 절단 부위는 다음과 같습니다:

5' ... gtpy ↓ puac ... 3'

3' ... 카프 ↑ 파이팅 ... 5'

그 이후로 점점 더 제한적인 내체효소가 발견되었는데, 그 중 많은 것이 이미 실천에 적용되었다. ECOR I 는 가장 널리 사용되는 제한 내체 효소로, 절단 부위는 다음과 같습니다.

5' G↓AATTC 3'

3' CTTAA↑G 5'

제한적인 내체효소의 명명은 주로 출처에 따라 숙주 이름, 균주 번호 또는 생물형을 포함한다. 명명할 때 숙주 속명의 첫 글자, 종명의 처음 두 글자, 균주 번호, 그리고 일련 번호 (로마) 를 붙인다. Hindⅲⅲ 제한 내체효소, Hin 은 인플루엔자, D 는 균주 Rd, iii 는 일련 번호를 가리킨다. 이전에는 제한적인 내체효소와 손질효소 앞에 R 이나 M, 균주 번호와 일련 번호를 소문자로 추가했다. 하지만 지금은 제한적인 내체효소 이름 중 R 이 생략되었습니다.

1986 의 후반부에서 6 15 종의 제한 효소와 98 종의 메틸화 효소가 발견되었다. 1998 에서 10000 종의 세균이나 고세균 중 3000 종의 효소가 발견되고 효소는 200 여종의 특이성을 가지고 있다. 2005 년 6 월 5438+ 10 월까지, * * * 4342 종의 제한 효소와 메틸화 효소가 발견되었는데, 그 중 368 1 종 제한 효소는 59 종의 ⅰ 제한 효소, 36/KLOC 를 포함한다.

3. 시스템 유형 제한 및 수정

효소의 하위기 구성, 식별 시퀀스의 유형 및 보조인자가 필요한지 여부에 따라 제한과 손질 시스템은 최소한 네 가지 범주로 나눌 수 있다. 표 2-2 는 다양한 제한 사항과 수정 시스템의 비교입니다.

ⅱ 클래스 제한 및 수정 시스템 비율이 93% 로 가장 큽니다. ⅱ 형 효소는 비교적 간단하다. 이들은 회문 대칭 서열을 식별하고 회문 서열 내부나 부근의 DNA 를 잘라서 3'- 히드 록실 및 5'- 인산 기단이 있는 DNA 생성물을 생산한다. 그들의 활성성은 Mg2+ 를 필요로 하고, 그에 상응하는 수식효소는 SAM 만 있으면 된다. 식별 순서는 주로 4-6bp 또는 더 길고 이중 대칭이지만, 몇몇 효소는 더 긴 서열이나 간결성 서열을 식별하는데, 효소와 효소 사이의 절단 위치는 다르고 일부는 분리되어 있다.

II S 형 제한손질시스템은 5% 를 차지하며 II 형과 비슷한 하위요소 요구 사항을 가지고 있지만, 식별점은 비대칭적이고 불연속적이며 길이는 4-7bp 이며, 절단점은 식별점측 20bp 이내일 수 있습니다.

II 형 제한 내체효소는 일반적으로 같은 이합체로, 두 개의 동일한 아기가 반대 방향으로 결합되어 있으며, 각 아기는 DNA 체인의 두 개의 보완점에 작용한다. 변형 효소는 단량체이며, 변형은 일반적으로 두 개의 메틸 전이 효소에 의해 이루어지며, 각각 하나의 사슬에 작용하지만, 두 사슬의 메틸화 염기는 다르다.

또 다른 특수한 유형의 II 형 제한효소가 있는데, 이중 체인 DNA 의 체인 하나만 잘라서 틈새를 만들어 낸다. 이 제한 효소는 N.Bst NBI 와 같은 절개 효소라고도 합니다.

유형 ⅰ 제한 및 수정 시스템 유형이 적고 1% 만 차지합니다 (예: EcoK 및 EcoB). 그것의 제한 효소와 메틸화 효소 (즉, R 야키와 M 야기) 는 효소 분자에 각각 하나의 아키로 존재하고, DNA 서열을 인식하는 S 아기는 각각 hsdR, hsdM, hsdS 유전자로 코드화되어 같은 조작자 (전사 단위) 에 속한다. EcoK 코딩 유전자의 구조는 R2M2S 입니다. EcoB 코딩 유전자의 구조는 R2M4S2 입니다.

EcoB 효소의 식별점은 아래와 같다. 그중 두 가닥 중 A 는 메틸화 부위이고, N 은 임의의 염기를 나타낸다.

TGA*(N)8TGCT

EcoK 효소의 인식 부위는 아래와 같다. 그중 두 가닥 중 A 는 가능한 메틸화 부위이다.

AA C(N)6GTGC

EcoB 와 EcoK 효소의 절단점은 1000bp 의 식별점 외에 특이성이 없다.

ⅲ 유형 제한 및 수정 시스템 유형이 적어 1% 이하 (예: EcoP 1 및 EcoP 15) 를 차지합니다. 그들의 인식 지점은 각각 AGACC 와 CAGCAG 이고, 절단 지점은 하류 24-26bp 에 있다.

유전자 조작에서, 일반적으로 제한 효소나 수정 효소는 달리 명시되지 않는 한 II 형 시스템의 유형을 가리킨다.

표 2-2: 다양한 제한 사항 및 수정 시스템 비교

ⅱ ⅰ ⅲ

효소 분자

내체 효소와 메틸화 효소

분자가 함께 있지 않다.

트리 에틸렌 이중 기능 효소

이중 서브 유닛 이중 기능 효소

부위를 식별하다

4-6bp, 주로 회문 대칭 구조.

이분법 비대칭

5-7bp 비대칭

절단 부위가 인식 부위 내부 또는 근처에 있습니다.

특이성이 없어 사이트 밖에서 최소한 1000bp 를 식별합니다.

사이트 하류 24-26bp 를 식별합니다.

제한 반응 및 메틸화 반응

단독 반응

서로 배척하다

동시에 경쟁하다

ATP 를 제약에 사용해야 합니까?

아니

이다

이다

둘째, 제한 엔도 뉴 클레아 제 인식 시퀀스

1. 효소 인식 시퀀스의 길이 제한

제한 효소 인식 시퀀스의 길이는 일반적으로 4-8 개의 염기로, 가장 흔한 서열은 6 개의 염기이다 (표 2-3). 인식 시퀀스가 4 와 6 개의 염기일 때 인식할 수 있는 시퀀스가 완전히 무작위일 때 평균 256 과 4096 개의 염기마다 하나의 인식점 (4 4 = 256, 4 6 = 4096) 이 나타납니다. 다음은 몇 가지 대표적인 유형이며 화살표는 절단 위치를 나타냅니다.

4 개의 염기 인식 부위: Sau3Aⅰ↓GATC

5 개의 염기 인식 부위: 에코 ⅱ ↓ CCW gg

NCIⅰCC↓SGG

6 개의 염기 인식 부위: 에코 ⅰ g ↓ aa TTC

HindⅲA↓AGC TT

7 개의 염기 인식 부위: BbvCⅰCC↓TC AGC

PpuMⅰRG↓GWCCY

8 개의 염기 인식 부위: NotⅰGC↓GGCCGC

SFIⅰGGCCNNNN↓ng gcc

위 시퀀스에서 일부 문자가 나타내는 염기는 다음과 같습니다.

R=A 또는 G Y=C 또는 T M=A 또는 c 입니다.

K=G 또는 T S=C 또는 G W=A 또는 t 입니다.

H=A 또는 c 또는 T B=C 또는 g 또는 T V=A 또는 c 또는 g 입니다.

D=A 또는 g 또는 T N=A 또는 c 또는 g 또는 t

효소 인식 시퀀스의 구조를 제한하십시오.

제한 내체 효소 인식의 순서는 대부분 회문 대칭 구조이며, 절단 부위는 DNA 두 체인의 대칭 위치에 있다. ECOR I 와 Hindⅲⅲ III 의 식별 시퀀스 및 절단 위치는 다음과 같습니다.

에코 ⅰ g ↓ aa TTC hind ⅲ a ↓ AGC TT

CTTAA↑G TTCGA↑A

ACCBS I [CCGCTC (-3/-3)] 및 BSSS I [CTCGTG (-5/-1)] 와 같은 일부 제한 효소의 인식 순서는 비대칭적입니다. 식별 시퀀스 뒤의 괄호 안의 숫자는 두 체인에서 절단 위치를 나타냅니다.

AccBSⅰCCG↓CTC BssSⅰC↓TCGTG

GGC GAG GAGCA C

일부 제한 효소는 여러 개의 서열을 식별할 수 있다. 예를 들어 AccⅰI 가 인식하는 시퀀스는 GT↓MKAC 입니다. 즉, 네 개의 시퀀스를 식별할 수 있습니다. 그 중 두 개는 대칭이고 나머지 두 개는 비대칭입니다. Hindⅱⅱ 식별 시퀀스는 GTY RAC 입니다.

효소 인식을 제한하는 일부 시퀀스는 불연속적이고 대칭이며 대칭 시퀀스 사이에는 몇 개의 임의 염기가 있다. ALWN I 및 DDE I 와 같이 식별 순서는 다음과 같습니다.

AlwNⅰCAGNNNC↓TG DdeⅰC↓TNAG

Gt ↑ cnngac gant ↑ c

3. 효소 절단의 위치 제한

제한 내체 효소는 DNA 의 절단 부위를 대부분 안에 있지만, 일부는 밖에 있다. 밖에는 양끝, 양쪽, 한쪽이 있습니다. 양끝의 접선은 각각 Sau3ai (↓ gatc), Nlaⅲ(CATG↓), ECOR II (↓ CCWG) 등이다. 양쪽에 BCG ⅰ [(10/12) CGA (n) 6 tgc (12/1 카드 모종 I 의 절단 특성은 다른 효소와 달리 인식 지점의 양쪽 끝에 중단점을 절단합니다. BBV I I [GC AGC (8/12)] 와 BSPM I [ACCTGC (4/8)] 의 접선이 인식점 밖에 있습니다.

Bcg ⅰ ↓10 (n) CGA (n) 6 tgc (n)12 ↓ tspr ⅰ nn CAC (g) tgnn 8500

↑12 (n) CGA (n) 6acg (n)10 ↑ nngtg (c) acnn

셋째, 효소 생산의 종점을 제한한다

1. 효소가 일치하는 끝을 생성하도록 제한합니다.

인식 지점이 회문 대칭 구조인 시퀀스는 제한적인 내체효소에 의해 절단되고, 결과 끝은 일치하는 점성 끝, 즉 점성 끝입니다. 이렇게 형성된 두 끝은 동일하고 상호 보완적입니다. 대칭축의 5' 쪽에서 베이스를 자르면 DNA 이중 체인이 번갈아 부러져 ECOR I 와 같은 5' 튀어나온 점성 끝이 생성됩니다. 3' 끝에서 자르면 Kpn 과 같이 3' 튀어나온 점성 끝이 생성됩니다.

NNG 1 호 NNG

GNN·GNN

효소가 평평한 끝을 생성하도록 제한하십시오.

회문 대칭축에서 두 개의 DNA 를 동시에 자르면 hae ⅲ (gg ↓ cc) 와 EcoRV(GAT↓ATC) 와 같은 평평한 끝이 생성됩니다. 끝이 평평한 DNA 는 자유롭게 연결할 수 있지만, 연결 효율성은 끝이 끈적끈적한 DNA 보다 낮습니다.

제한 효소는 비대칭 돌출 끝을 생성합니다.

많은 제한적인 내체효소가 DNA 를 절단하면 비대칭적인 돌출단이 생긴다. 인식 시퀀스가 비대칭일 때 잘라낸 DNA 산물의 끝은 BBVC I 와 같이 다르며, 그 식별 절단 지점은 다음과 같습니다.

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

일부 제한 효소는 퇴화 서열을 식별하고, 일부 식별 서열은 비대칭적이다. ACC I 와 같이, GTAGAC 와 GTCTAC 가 비대칭인 분해 지점을 식별합니다.

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

Draⅲⅲ 및 EAR I 와 같은 일부 제한 효소 인식 간격 영역 시퀀스는 임의적입니다.