살아있는 세포와 죽은 세포의 식별은 생물학과 의학에서 중요한 의의가 있다. 세포 배양 과정에서 수시로 세포의 성장 상황을 기록하기 위해서는 세포의 생존율을 자주 측정해야 한다. 종양세포 연구에서 각종 약물이 종양세포에 미치는 살상력을 테스트하기 위해서는 종양세포의 생존율도 측정해야 한다. 임상의학에서는 살아있는 세포와 죽은 세포의 인식도 큰 응용이 있다. 예를 들어, 남성의 생식력을 검사하기 위해 흔히 사용되는 방법은 정자 세포의 활력을 측정하는 것이다.
죽은 세포와 살아있는 세포를 감별하는 방법에는 염색과 기기 분석을 포함한 여러 가지가 있다. 염색은 세포의 생사를 감정하는 일반적인 방법으로, 간단하고 조작하기 쉽다. 그러나 직접적인 형태학 관찰을 통해 세포가 살아 있는지 죽었는지 판단하고, 실험 결과는 조작자의 주관적 요인에 쉽게 영향을 받아 약간의 오차가 있다. 따라서 실제 작업에서 정확한 배치 테스트를 위해 일부 기기를 자주 사용합니다.
죽은 세포 감별 방법마다 구체적인 반응 메커니즘이 다르지만, 어떤 방법을 사용하든 죽은 세포의 생리 기능과 성질의 차이를 이용한다.
일반적으로 사용되는 방법에는 염색 및 계측 분석이 포함됩니다.
1 염색법
염색 방법은 화학 염색법과 형광 염색법으로 나눌 수 있다. 염색 메커니즘에 따라 염료는 죽은 세포와 살아있는 세포를 모두 염색할 수 있다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 생리 기능과 성질상의 차이는 주로 다음을 포함한다.
살아있는 세포와 죽은 세포 세포막 투과성의 차이: 살아있는 세포의 세포막은 선별적인 막으로 세포에 보호와 장벽 역할을 하며, 물질선택성 통과만 허용한다. 세포가 죽은 후 세포막이 손상되어 투과성이 증가하였다. 대람블루가 세포의 생사를 구별하는 일반적인 방법은 바로 이 성질을 이용하는 것이다. 대만은 파란색으로 보입니다. 테판 블루라고도 하는 음이온 염료로, 완전한 세포막을 관통할 수 없다. 따라서 탁람청색 염색을 한 후에는 죽은 세포만 염색할 수 있고, 살아있는 세포는 염색할 수 없다. 메틸 블루도 비슷한 염색 메커니즘을 가지고 있습니다. 식물 세포의 질벽 분리도 생사를 식별할 수 있다.
살아있는 세포와 죽은 세포의 대사 차이: 메틸렌 블루 염료가 효모 세포를 감별하는 근거이다. 메틸렌 블루는 일종의 무독성 염료로, 그 산화 형식은 파란색이고, 복원 형식은 무색이다. 살아있는 세포에서 대사를 하기 때문에 세포는 강한 복원력을 가지고 있어 메틸렌 블루를 파란색 산화에서 무색 복원으로 바꿀 수 있기 때문에 메틸렌 블루로 염색한 생효모 세포는 무색이다. 죽은 세포나 대사가 느린 오래된 세포는 비복원력이나 복원력이 매우 약하기 때문에 메틸렌블루를 산화 상태로 만들어 파란색이나 연한 파란색으로 염색한다.
형광소 디 아세테이트 (FDA) 는 배양 된 동물과 식물 세포의 원형질체의 활력을 확인하는 데 일반적으로 사용되는 염료입니다. 그것의 염색 기계도 살아 있는 세포와 죽은 세포의 대사 차이를 이용한다. FDA 자체는 형광을 발생시키지 않고 비극적이어서 완전한 세포막을 자유롭게 관통하고 뚫을 수 있다. FDA 가 살아있는 세포에 들어오면 세포 내에서 리파아제에 의해 분해되어 형광을 생성하는 극성물질인 형광소를 생성하는데, 이는 살아있는 세포막을 자유롭게 관통하고 세포막에 축적하여 살아있는 세포가 녹색 형광을 생성하도록 할 수 없다. 그러나, 활동적이지 않은 세포는 FDA 를 분해할 수 없기 때문에 형광을 생산할 수 없다.
또한 세포 소기관의 특수 염료도 있습니다. 액포 시스템의 특수 염료 중성 레드와 같은. 중성홍은 저독성 염료로 살아있는 세포의 액포를 빨갛게 하지만 세포질과 세포핵은 음영처리되지 않는다. 죽은 세포의 액포는 음영이나 연염으로 물들지 않고, 염료는 세포 전체에 흩어져 있고, 세포핵과 세포질은 붉은색으로 염색된다. 때때로 염색 효과를 높이기 위해 메틸렌 블루-중성 레드 혼합 염색법과 같은 두 가지 염료를 혼합해서 사용할 수 있다.
2 기기 분석 방법
마이크로전극 기술 (살아있는 세포막과 죽은 세포막 양쪽의 전위차 사용), 자동세포 카운터, 스트리밍 세포계는 세포의 생사를 대량으로 정확하게 감지할 수 있다.
독일 INNOVATIS 가 생산하는 완전 자동 Cedex 세포 생존율/세포 카운터/세포 분석기는 세계 최초의 고해상도 HD 스캔 (특허) 세포 분석기로, 자동 탁상 블루 염색, 마이크로CCD 이미징 및 CEDEX 워크스테이션 소프트웨어를 갖추고 있어 제약, 의료, 발효, 면역, 병리 등에 사용할 수 있습니다. 자동 분석 결과, 검사 분석 데이터 출력 (1 1 항목): 총 세포 수, 총 세포 농도 (세포/ML); 살아있는 세포의 수와 농도 (세포/밀리리터); 사망 세포의 수와 농도 (세포/밀리리터); 세포 생존율 (%); 세포의 평균 진원도; 평균 세포 직경 (μ m); 집결률 세포 직경 히스토그램; 막대 그래프 수집 세포 진원도 히스토그램; 세포 성장 시간도.
유동 세포 계측법은 세포의 생사를 판단하는 데 일반적으로 사용되는 두 가지 형광 프로브가 있습니다. 하나는 살아있는 세포막을 관통하여 형광을 방출하는 물질입니다. 예를 들어 FDA 는 살아 있는 세포에 의해 보유될 수 있고 황록색 형광을 방출할 수 있다. 세포가 손상되면 세포에서 사라지고 형광을 관찰할 수 없다. 또 다른 종류는 살아있는 세포막을 관통할 수는 없지만, 고정 세포와 막 손상 세포의 핵을 염색할 수 있다. 예를 들어, 요오드화 C (PI) 와 브롬화 B (EB) 는 일반적으로 두 번째 유형의 형광 프로브로 사용됩니다. 요오드화병괴 (PI) 는 세포막을 관통할 수 없고 세포막의 완전한 정상 세포나 시들어가는 세포를 염색할 수 없다. 악사세포의 경우 세포막의 무결성이 상실되고 요오드화병괴 (PI) 가 악사세포를 염색할 수 있다. 현재 많이 쓰이는 세포 시들어 죽고 괴사 검사 테스트 키트 Hoechst 33342 와 요오드화프로판 (PI) 이 함유되어 있다. 시들어 죽을 때 염색질이 수축되고, Hoechst 33342 는 세포막을 관통할 수 있으며, 염색한 후 시들어가는 세포의 형광이 눈에 띄게 증가한다. 두 염료의 이중 염색 후, 정상 세포는 약한 적색 형광+약한 파란색 형광, 세포 사멸 세포는 약한 적색 형광+강한 파란색 형광, 괴사 세포는 강한 적색 형광+강한 파란색 형광을 보였다.