ShRNA 는 줄기세포, 신경세포, 배아 줄기세포 등 전염되기 어려운 세포에서 단백질을 효율적으로 표현할 수 있다. 그의 시동은 모두 외원이며, 단백질을 표현한 번역 후 수식이 진실이 아닐 수도 있고, TALEN 은 그의 결함을 더 잘 보완할 수 있다. 첫째, 표적 인식 모듈이 구축되었습니다. TALE 의 핵산 인식 단위는 반복되는 34 개의 상수 아미노산 시퀀스이며, 여기서 12 및 13 비트의 이중 아미노산은 A, G, C, T 와 일정한 대응 관계, 즉 ng 인식 T, HD 인식 C, NI 인식 A, NN 인식 종의 게놈 크기가 다르기 때문에 선택한 특정 서열의 길이도 다르다. 인간을 포함한 포유류의 경우 일반적으로 16-20bp 의 DNA 서열을 식별 대상으로 선택합니다. 둘째,
타론 유전자 녹아웃
핵산 내체효소 TALEn 은 특정 DNA 서열을 인식하는 Tale 과 핵산 내체효소 FokI 를 결합하여 만들 수 있다. 그리고 포키는 이합체를 형성해야 활동을 할 수 있어 무작위 전단의 확률을 크게 낮춘다. 실제 작업에서는 대상 유전자의 인코딩 영역 또는 외현자와 인트론의 경계에 인접한 두 개의 염기 (13-22 개의 염기) 의 목적 시퀀스 (일반적으로 16-20 개의 염기) 를 각각 선택하여 TAL 인식 모듈을 구축해야 합니다. 인접한 표적 인식 모듈 두 개를 융합하여 FokI 의 N 끝으로 복제하여 진핵 표현 벡터를 형성하여 TALEN 플라스미드 쌍을 얻습니다.
TALEN 플라스미드 쌍을 세포로 옮겨 대상 유전자를 제거할 수 있다. TALEN 플라스미드를 통해 * * * 를 세포로 전입한 후, 표현된 융합 단백질은 각각 과녁 부위 특이성과 결합되었다. 두 TALEN 융합 단백질 중 FokI 가 서로 가까워져 이합체를 형성하고 비특이적 내체효소의 활성화를 발휘하며 두 타깃점 사이에서 DNA 를 절단하여 DSB (쌍사슬 파열) 를 형성하여 DNA 손상 복구를 유도하는 메커니즘입니다. 세포는 NHEJ (비순합 끝 연결) 를 통해 DNA 를 복구할 수 있으며, 이 복구 과정에서 어느 정도 염기가 누락되거나 삽입되어 코드를 옮겨 목적 유전자 녹아웃 돌연변이를 형성할 수 있다.
탈리아 전사 활성화
특정 DNA 서열을 식별하는 TALE 과 전사 인자 활성화 도메인 VP64 를 융합하여 프로모터에 있는 특정 DNA 서열을 식별하는 전사 활성화 계수 TALEA 를 구축합니다. 실제 작업에서는 대상 유전자 하위 업스트림 대상 시퀀스 (일반적으로 12- 18 염기) 를 선택하여 TAL 인식 모듈을 구축해야 합니다. 인식 모듈 TALE 을 융합하여 VP64 의 N 단에 복제하여 진핵 표현 플라스미드 TALEA 를 형성합니다. TALEN 플라스미드를 세포로 옮기고, 표현된 융합 단백질과 프로모터 근처의 특정 DNA 서열을 결합하고, VP64 활성화 영역을 통해 Pol II 와 결합하여 유전자 전사를 활성화하고 내원 목적 유전자의 표현을 높인다.