고통측정순서 기술과 생물정보학이 발달하면서 수천 가지의 circRNA 가 발견되면서 circRNA 를 둘러싼 기초연구도 늘고 있다. 대량의 연구에 따르면 circRNA 는 포유류 세포에서 내원성, 풍부함, 보수적, 안정성이며, 조직 또는 시공간적 특이성을 자주 보여주며 다양한 메커니즘을 통해 기체 성장과 질병의 발생 조절에 참여할 수 있는 것으로 나타났다. 이에 따라 최근 몇 년간 circRNA 는 비코딩 RNA 연구 분야의 핫스팟이 되고 있다.
CircRNA 시퀀스의 출처에 따라 1 의 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 시퀀스는 모두 엑손 circRNAs 라고 불리는 엑손 (circrnas) 에서 나온 것입니까? 2.? 시퀀스는 엑시나스라는 외현자와 인트론에서 유래한 것인가요? 이러한 시퀀스는 모두 ciRNAs 라는 인트론에서 나옵니다.
CircRNA 는 이전 mRNA 의 반전 절단에 의해 형성된다. 현재 보고 된 링 모델은 크게 세 가지가 있습니다.
-응? 인트론 역 상보성 시퀀스 구동 고리 화
외현자의 양쪽 끝에 있는 측면 날개 인트론에는 여러 쌍의 역방향 보완 서열이 포함되어 있어 인트론 서열 쌍을 촉진하고 하류 스플라이싱 공급체가 업스트림 스플라이싱 수용체에 가까워져 고리 모양의 RNA 를 형성한다. (그림 1. 왼쪽)
-응? RNA 결합 단백질 구동 고리 화
고리 화현자 양끝의 측면 날개 인트론에는 RNA 결합 단백질 (RBPs) 식별의 기본 순서가 포함되어 있습니다. RBPs 가 별관 인트론의 특정 베이스 시퀀스와 결합되면 이량 체가 형성되어 별관 인트론이 서로 가까워지고 링으로 연결됩니다. (그림 1. 오른쪽)
-응? 올가미 구동 고리
MRNA 전구체가 절단될 때 외현자 점프 이벤트가 발생하여 외현자와 인트론이 포함된 올가미 중간체를 만든 다음 중간체가 반전되어 고리형 RNA 를 형성합니다. (그림 2. ) 을 참조하십시오
CircRNA 의 가장 일반적인 기능은 miRNA 의 스펀지와 miRNA 를 결합하여 miRNA 의 유전자 조절에 영향을 미치는 것이다. 예를 들어, Cdr 1as, 반의사슬 전사 고리 RNA 분자, 소뇌 변성과 관련된 단백질 유전자, miR-7 의 약 70 개 결합점과 miR-67 1 의/KLOC 를 많이 연구했다. Cdr 1as 가 높은 표현을 할 때 miR-7 이 결합되어 원암 유전자의 mRNA 를 억제할 수 없어 원암 유전자의 표현을 높여 암을 유발한다. MiR-67 1 높은 표현이 있을 때 Cdr 1as 가 분해되고, miRNA 가 방출되고, 원암 유전자 mRNA 와 결합해 유전자 인하 작용을 발휘하여 암 발생을 억제한다. (그림 3. ) 을 참조하십시오
많은 링 RNA 에는 단백질 스펀지로 사용할 수 있는 단백질 결합 부위가 포함되어 있다. 예를 들어 RNA 전단인자 Mbl 은 친본 유전자의 제 2 외현자와 결합해 환화를 촉진하여 circ-Mbl 을 형성하고, circ-Mbl 은 Mbl 과 결합하여 MBL 의 유효 농도를 낮추고 MBL 생성을 줄일 수 있다.
CircRNA 는 miRNA 와 단백질 스펀지일 뿐만 아니라 스텐트 단백질로 효소의 위치를 촉진하고, 전사 인자를 결합하여 목적 유전자의 표현을 억제하고, 친본 유전자의 표현을 조절하는 데 참여하며, 어떤 경우에는 폴리펩티드를 번역할 수도 있다. 관련된 기능에 따라 circRNA 의 세포 위치도 다르다. 예를 들어, miRNA 나 단백질 스펀지로 사용될 때, circRNA 는 핵에서 세포 기질로 운반해야 역할을 할 수 있으며, 이는 친본 유전자 표현을 조절하거나 전사 인자와 결합하여 과녁 유전자를 억제하는 데 관여할 때, circRNA 는 종종 세포핵에서 작용한다.
(참고 문헌: 크리스텐슨, L.S., 앤더슨, M.S., 스타거스테드, L.V., 에베슨, K.K., 핸슨, T.B.,&; Kjems, J. (20 19). 고리형 RNA 의 생물 발생, 생물학 및 표상. -응? "자연평론유전학"? 20 (11), 675-691.)
점점 더 많은 내원성 circRNA 가 인체 조직에서 광범위하게 표현되면서 circRNA 와 질병의 관계가 점차 주목의 초점이 되고 있다. 현재 가장 많이 연구되고 있는 것은 circRNA 와 실체종과의 관계, 그리고 두경부 비늘암의 CIRC PVT1과 같이 종양 형성을 촉진하는 circRNA 입니다. Cirs-7(CDr 1as) 은 결장암, 식도 비늘 세포암, 간세포암에서 표현된다. 콜로이드 모세포종에서 circsMARCA5 및 circ-SHPRH 와 같은 종양 circRNA 를 억제합니다. 또 다른 circRNA 는 직장암의 원암 유전자인 circHiPK3 과 같이 다른 조직이나 세포에서 다른 역할을 할 수 있지만 방광암에서 암세포를 억제한다.
암 외에도 circRNA 는 당뇨병, 심혈관 질환, 만성 염증, 신경계 질환과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 생명기술의 발전과 circRNA 에 대한 연구가 깊어짐에 따라 circRNA 의 형성과 메커니즘이 더욱 명확해지고 질병의 예방, 검사 및 치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 믿는다.
CircRNA 녹아웃 프로그램은 설계하기가 어렵습니다. 일반적으로 다음 두 가지 방법을 사용합니다.
시나리오 1: circRNA 외현자의 양끝에 두 개의 gRNA 를 디자인하고, 고리 화현자 서열을 직접 두드린다. 이 방안은 완전히 두드리는 것이지만, circRNA 를 두드리면 단백질을 인코딩하는 친본유전자에도 영향을 미치므로 구체적인 실험 목적에 따라 가능한지 여부를 고려해야 한다. -응?
시나리오 2: circRNA 를 파괴하여 링을 형성하여 노크를 실현하다. 먼저 circRNA 의 링 구성요소를 찾아야 하는데, 일반적으로 고리 화현자 양끝에 있는 긴 별관 인트론입니다. 고리가 발견되면 양쪽 끝에서 gRNA 를 디자인하여 두드리면 코드화된 유전자의 외현자뿐만 아니라 circRNA 를 제거할 수 있다 (그림 4). ) 을 참조하십시오
응용 사례:
Circ-HIPK3 는 인체 세포에 대량으로 존재하는 고리형 RNA 입니다. 그것은 많은 miRNA 와 결합할 수 있으며, 세포 성장의 조절제로 종양의 형성에 영향을 줄 수 있다. Circ-HIPK3 의 링 메커니즘을 검증하기 위해서는 별관 안에 있는 링 구성요소를 찾아 업스트림 및 다운스트림 예측 링 구성요소에 대해 각각 한 쌍의 sgRNA 를 설계하고, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 예측 링 구성요소를 노크하여 circRNA 의 표현이 변경되었는지 여부를 탐지해야 합니다. PCR 과 RT-QPCR 을 통해 하류 링 구성요소를 두드린 후, circHIPK3 의 표현이 현저히 낮아졌고, 상류 링 구성요소를 두드린 후, circHIPK3 의 표현은 인하되지 않고 상향 조정됐다. 업스트림 링 요소 시퀀스가 너무 많아서 예측이 정확하지 않은 것으로 추정된다. 링화가 다른 링화 컴포넌트에 의해 구동된다는 것을 추가로 검증하기 위해 gRNA5 또는 GRNA6 * * 으로 각각 gRNA3 또는 gRNA4 를 주사하여 링화 컴포넌트 상류의 큰 인트론을 제거한다. RT-QPCR 결과에 따르면 circHIPK3 의 표현이 확실히 하락하여 다른 링 구성요소가 상류에서 링 역할을 한다는 것을 알 수 있습니다.
(참고 문헌: 정, 진, 바오, 진, 곽, 리, 진 ... 빔 (20 16). 링 RNA 지도는 스폰지의 다양한 miRNAs 를 통해 세포의 성장을 조절하는 풍부한 고리 3 을 밝혀냈다. -응? 자연통신? 7( 1), 1- 13.)
CircRNA 기능을 연구하는 방법 중 circRNA 를 억제하는 가장 고전적인 방법은 RNAi (shRNA) 를 통해 circRNA 를 노크하는 것이다. MRNA 에 영향을 주지 않도록 설계 시나리오의 간섭 시퀀스는 BSS (역방향 스플릿 사이트) 에서 설계해야 합니다.
고효율 shRNA 를 설계함으로써, 원정생물은 느린 바이러스법을 통해 간섭 벡터를 세포로 옮기고, 대조군 세포가 모두 사망할 때까지 최적의 약물 선별 농도에 따라 세포를 선별하여 circRNA 가 노크하는 안정세포주를 얻는다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 건강명언)
응용 사례:
SiRNA 로 제거한 후 세포 증식과 시들어가는 것을 검사한 결과, circ-HIPK3 녹아웃이 세포 증식을 억제한다는 것을 알 수 있다. 우선, HIPK3 mRNA 의 선형 전사, circ-HIPK3 의 원형 전사, 그리고 두 개의 전사 * * *, siRNA 가 HEK-293 에서 설계된 세 가지 실험을 설계했습니다. T 세포주에 설계된 siRNA 는 해당 전사물만 방해한다.
CCK-8 과 EdU 세포 증식과 시들어 테스트 키트 검출 세포 증식과 시들어 떨어지는 것을 검출하다. 그 결과, HIPK3 mRNA 의 낮은 노크는 세포 증식에 큰 영향을 미치지 않는 반면, circ-HIPK3 의 낮은 노크는 세포 증식을 현저히 억제하는 것으로 나타났다.
(참고 문헌: 정, 진, 바오, 진, 곽, 리, 진 ... 빔 (20 16). 링 RNA 지도는 스폰지의 다양한 miRNAs 를 통해 세포의 성장을 조절하는 풍부한 고리 3 을 밝혀냈다. -응? 자연통신? 7( 1), 1- 13.)
CircRNA 의 과표현은 줄곧 비교적 어려웠는데, 예를 들면 고리의 효율이 낮고, 고리가 잘못 배합되기 쉽다. CircRNA 는 RBP 의 결합 지점 (예: 링 요소 및 QKI) 을 최적화하여 정확하고 효율적으로 링할 수 있습니다. 과다 표현 후에도 링이 성공적으로 형성되었는지, 선형 mRNA 가 표현되었는지 여부를 검사해야 한다. 새로운 링 RNA 전달체의 표현 시스템의 효율성을 연구하기 위해 쥐 링 유전자 4 를 선택하여 다양한 세포계 (Hela, N2a, HEK293 포함) 에서 표현 검증을 실시한다. RT-QPCR 이 서로 다른 세포주에서 실험한 자료에 따르면, 새로운 전달체 시스템인 PCIRRNA-DMO-RTN4 는 여러 가지 다른 세포주에서 일반 전달체 시스템 (PCIRRNA-Be-RTN4) 보다 훨씬 효율적입니다.
Northern 각인은 circRNA 를 감지하는 금 표준이며, 프로브는 일반적으로 역방향 스플릿 사이트 설계를 통해 설계됩니다. 하지만 Northern 각인은 많은 circRNA 를 필요로 하고, 시간이 많이 걸리고, 프로브는 일반적으로 방사능을 가지고 있어 조작이 더 어렵다. (윌리엄 셰익스피어, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 과학명언) 일반적으로 사용되는 감지 시나리오는 RT-PCR 또는 RT-QPCR 로, 역방향 스플라이싱 사이트 양쪽 끝에 프라이머를 디자인합니다. (그림 9. ) 을 참조하십시오