MSK-IMPACT 는 종양 조직의 FFPE 샘플과 정상 샘플에 대한 패널 캡처, NGS 시퀀싱 및 글자 분석을 통해 게놈의 종양 유전자 돌연변이를 광범위하게 감지할 수 있습니다. 그것의 시퀀싱 플랫폼은 Illumina HiSeq 입니까? 2500 시퀀서 (MSK 자격), 탐지된 돌연변이 유형은 SNVs, Indel (
부칙 부록 1a 는 MSK-IMPACT 의 감지 핫스팟을 나열하고, 부칙 부록 1b 는 468 개의 유전자와 그에 상응하는 전사본 정보를 나열하며, 부칙 부록 1c 는 73 개의 유전자와 외현자 지역 정보를 나열하고,
품질 관리에는 종양 세포 함량이 10% 보다 크고, 슬라이스 함량이 20% 보다 크고, MSI 가 종양 세포 함량이 25% 보다 크다고 합니다.
생략
순합 점 일관성을 사용하여 동일한 샘플에서 정상 샘플과 종양 샘플의 쌍을 탐지하면 일치하는 샘플의 순합 점 불일치가 낮을 것으로 예상할 수 있습니다 (; 5%), "페어링되지 않을 수 있음" 유형으로 표시됩니다.
잡합 부위의 서로 다른 등위 유전자의 빈도를 감지하고 빈도가 비정상인 경우 샘플을' 오염될 수 있음' 유형으로 표시합니다.
정상 샘플에는 SNVs 및 INDEL 이 포함되어서는 안됩니다. 분석 프로세스는 핫스폿의 변동 빈도가 있는 경우 일반 샘플에서 변이 핫스폿을 감지합니다. 1%, 치수 샘플.
SNVs( MuTect 소프트웨어) 및 INDELs( SomaticIndelDetector 소프트웨어) 호출 돌연변이 프로세스에는 정상 샘플이 없거나 정상 샘플의 평균 시퀀싱 깊이가 낮은 경우 정상 및 종양 페어링 샘플이 필요합니다 (
NC 샘플의 분석은 오염이 없는지 확인하는 데 사용되고, PC 샘플의 분석은 분석의 민감도를 보장하는 데 사용됩니다.
종양 샘플의 품질 관리에는 98% 의 외현자가 200X 이상을 덮고 정상 샘플 깊이가 50X 이상이어야 한다.
초기 SNV 와 인델 돌연변이는 보고된 돌연변이의 정확성을 보장하기 위해 다음 시리즈를 통해 선별해야 합니다.
(1) vftumor/vfnormal > =5, AD & gt=5, VF>= 1%
(2) 돌연변이가 핫스팟 돌연변이 라이브러리에 있는지 여부, 부록 1a 가 핫스팟 목록입니다.
(3) 핫스팟: DP & gt=20, 광고> = 8, VF & gt=2%; 핫스팟이 아님: DP & gt=20, AD>= 10, VF >=5%
(4) 주석 결과를 필터링하고 외현자 영역에 있는 동의어가 아닌 돌연변이와 변이 코드 돌연변이를 유지합니다.
MSK-IMPACT 가 적용되는 모든 MSI 사이트의 상태는 MSIsensor 소프트웨어에 의해 계산됩니다. MSIsensor 는 점수를 계산하고 임계값이 10 보다 크면 MSI-H 로 표시합니다 .....
환자의 조직이나 외주혈은 정상 샘플로, 부적절한 정상 샘플을 대량으로 사용하면 희귀한 종계 돌연변이가 체세포 돌연변이로 작용할 수 있다.
양성 대조는 세 가지 양성 샘플의 혼합물 (각각 다른 유형과 빈도의 돌연변이 정보 포함) 이며, 양성 대조의 정상 샘플은 통일된 배치의 정상 샘플의 혼합물이다. 프로세스 분석 후 분석 결과를 테스트합니다. (1) 알려진 돌연변이가 감지됩니까? (2) 검출 된 돌연변이 주파수가 원래 샘플과 일치합니까? 표 2 는 알려진 돌연변이 빈도의 샘플이다.
음성 대비 샘플은 이전 반복 실험을 통해 입증된 무종양 오염, 무종 사본 수 돌연변이가 있는 FFPE 정상 샘플의 혼합물이다. 이전 분석에서는 정상 샘플의 특정 다형성과 빈도를 파악했으며, 이 과정에서 생성된 862 개의 SNP 의 돌연변이 빈도를 예상 돌연변이 빈도와 비교하여 피어슨 일관성을 계산했습니다. 예상되는 돌연변이 빈도는 0.9 보다 커야 합니다
템플릿 컨트롤 없음 (NTC)
샘플 품질 관리 지표:
여기서는 전력 분석의 개념을 사용하여 필요한 적용 깊이를 계산합니다.
1a 엑손 덮개 깊이 측정:
잠재적인 최소 테스트 선이 2% 로 설정된 경우 성능 분석을 통해 상당한 수준의 읽기 깊이를 계산할 수 있습니다. 예를 들어 돌연변이 빈도가 10% 인 경우 500X 깊이의 95% 신뢰 구간에서 돌연변이 주파수의 범위는 7.5%- 13% 사이입니다.
따라서 무어 혼합 10 개의 관련이 없는 FFPE 정상 샘플을 기다리면서 최소 돌연변이 주파수가 5% 인 일련의 사전 설정된 돌연변이 빈도가 생성됩니다. 그런 다음 862 개의 SNPs 를 사용하여 사전 설정된 돌연변이 빈도와 실제 돌연변이 빈도 간의 관계를 확인합니다. 마지막으로, 실험 데이터는 5% 를 보고 탐지된 돌연변이의 하한선으로 지원하며, 실제 잠재적 주파수는 10% 입니다.
실행과 실행 사이에 복제품, 샘플당 5 개의 복제품을 설치하다.
1a 패널 정밀도 검증 (표준 검증)
10 샘플 (FFPE 샘플 9 개와 상업용 세포주 1 개) 은 다른 종양 유형, 다른 돌연변이 유형 (돌연변이 유형 알려진) 및 다른 돌연변이 빈도 (돌연변이 빈도 알려진) 를 나타냅니다.
2b 패널 정확도 및 반복 일관성 검증 (표준 검증)
알려진 돌연변이의 정확도를 평가할 때 표 6 은 반복 샘플에서 감지된 알려진 돌연변이 이외의 돌연변이의 반복성을 검증합니다.
5 개의 반복 샘플에서 감지된 모든 돌연변이의 일관성
5 개의 샘플에서 감지된 돌연변이 빈도의 일관성
표 7 에는 10 개의 테스트 샘플에 대한 정밀도 검증 결과 (샘플당 5 회 반복) 가 나와 있습니다.
LoD 는 95% 의 반복에서 안정적으로 감지할 수 있는 돌연변이의 등위 유전자 주파수이다. 이 부분은 가정 돌연변이를 검증하는 LoD 입니다. 테스트는 두 부분으로 나뉜다. 첫 번째 부분은 신뢰할 수 있는 최소 돌연변이 빈도를 결정하기 위해 그라데이션 희석입니다. 두 번째 부분은 여러 반복에서 LoD 를 확인하는 것입니다.
1그라데이션 희석
10 개의 FFPE 샘플을 선택하고 커버율이 가장 높은 5 개의 외현자와 커버율이 가장 낮은 5 개의 외현자를 선택합니다. 5-8 개의 그라데이션 희석액을 준비하다.
테스트 결과 테이블 10
1a SNV/indel 돌연변이 방법 비교
MSK 충격법과 MSK 충격법이 직교 검증을 거친 후의 원시 결과를 비교했다. * * * 433 개의 FFPE 샘플에서 20 개의 유전자의 엑손 48 개가 검출되어 총 267 개의 독특한 돌연변이 부위가 검출되었다. 알려진 돌연변이 * * * 는 433 개 샘플 중 432 개 샘플에서 발견되고, 한 샘플에서 EGFR 유전자의 삽입이 누락됐다.
일관성 테이블 15A-C-C 를 체크 아웃합니다.
MSK 가 보도한 돌연변이는 두 가지가 있다. 하나는 임상적 의의가 있는 암 돌연변이이고, 다른 하나는 잠재적으로 의미가 있는 암 돌연변이이다.
1a 임상 샘플 검증
MSK 는10,000 명 이상의 말기 암 환자를 테스트하고 의료 기록과 돌연변이 정보를 다음 사이트에 저장했다.
Https://www.cbioportal.org/study/summary? Id = MSK _ impact _ 20 17
Https://www.accessdata.fda.gov/cdrh _ docs/reviews/d en170058.pdf