포도씨 프로안토시아니딘의 추출 및 검출 방법

1 포도씨 프로안토시아니딘의 개념, 성질 및 안전성

1.1 프로안토시아니딘의 개념

연구에 따르면 포도씨의 유일한 프로안토시아니딘 물질은 프로안토시아니딘입니다[21. 프로안토시아니딘의 정의는 일정하지 않습니다. 프로안토시아니딘은 산성 매체에서 가열될 때 빨간색 안토시아닌을 생성하기 때문에 명명되었습니다3. 그러나 카테킨 단량체는 뜨거운 산성 조건에서 안토시아닌 없이 반응하므로 카테킨 단량체는 프로안토시아니딘으로 분류되어서는 안됩니다. 이 개념은 미국 포도씨 공법 평가위원회와 포도씨 추출물을 생산하는 국내 주요 기업들에서도 인정받고 있습니다. 포도씨 프로안토시아니딘은 C4-C 또는 C4-C를 통해 카테킨, 에피카테킨 및 이들의 갈산 에스테르로 구성됩니다. 이는 결합결합과 원자가 결합으로 구성된 중합체입니다. 일반적인 구조식은 그림 15J에 나와 있습니다. 이량체에서 사량체까지의 것을 보통 올리고머(OPC)라고 하고, 오량체 이상을 중합체라고 합니다.

R=3p-OH 카테킨, R=3p-O-갈레이트 카테킨 O-갈레이트 R-3a-OH 에피카테킨. R-3a-O 에피카테킨 오갈레이트

그림 1 프로안토시아니딘의 구조와 구성 단위

1.2 프로안토시아니딘의 주요 특성

프로안토시아니딘은 빨간색 안토시아닌을 생성할 수 있습니다 뜨겁고 산성인 조건에서 이 특성은 프로안토시아니딘의 정성 및 정량 분석에 사용될 수 있습니다. 구조에 수산기가 많고 극성이 높아 물, 메탄올, 아세톤, 에탄올과 같은 극성 용매에는 잘 녹지만 벤젠, 클로로포름, 석유 에테르와 같은 비극성 물질에는 녹지 않습니다. 하이드록실 구조가 많을수록 좋은 수소 원자 기증자가 되며 강력한 항산화 특성을 갖습니다. 연구 결과에 따르면 0:1, ·OH 및 ·CH 중에서 프로안토시아니딘은 0:1에서 가장 좋은 소거 능력을 가지며, 중합도 2~5 범위에서는 중합도가 높아질수록 효과가 증가하는 것으로 나타났습니다. 구조-활성 관계 분석은 갈로일 그룹을 가진 프로안토시아니딘이 더 강력한 항산화 활성을 가지며, 이량체의 항산화 활성이 단량체 카테킨보다 더 강하다는 것을 보여줍니다. cc 연결된 이량체는 cc 연결된 이량체보다 항산화 활성이 더 강력합니다. 프로안토시아니딘의 최대 흡수 파장은 280 nm 근처에 있어 강력한 UV 흡수 능력을 제공합니다. 위의 주요 특성으로 인해 프로안토시아니딘은 건강식품 및 화장품 개발에 매우 ​​적합합니다.

13 프로안토시아니딘 제품의 안전성

미국 크레이튼 대학교 포도씨 프로안토시아니딘 연구그룹과 미국 환경보호국이 공동으로 포도씨 프로안토시아니딘 추출물에 관한 연구를 진행했습니다. 일련의 독성 및 생물학적 효능 연구에 대한 독성 물질 통제 규정 건강 영향 시험 매뉴얼(GSPE). 결과는 GSPE가 높은 안전성과 우수한 활성산소 제거 및 항산화 능력을 가지고 있음을 입증합니다8. 일본 학자 야마코시(Yamakoshi) 등도 일련의 독성학 테스트를 통해 프로안토시아니딘이 풍부한 포도씨 추출물이 매우 안전하다는 것을 확인했습니다. 기능성 식품 개발에 활용 가능합니다.

2 프로안토시아니딘의 추출 방법

프로안토시아니딘을 추출하기 위해 일반적으로 사용되는 방법에는 물 추출, 유기용매-물 추출, 기기 보조 추출이 있습니다. . 포도씨에 함유된 프로안토시아니딘 성분은 일반적으로 단백질, 셀룰로오스와 결합된 상태로 fl01로 되어 있어 일반적으로 추출이 어려운데, 보통 유기용매나 물로 추출하는데, 이는 수소결합을 깨뜨리는 효과가 있습니다. 동시에 유기용매의 투과성이 낮기 때문에 일반적으로 단독으로 사용되지 않으며 물질 전달제로 물이 필요한 경우가 많습니다.

2.1 물 추출 방법

Masquelier~l-Nengzao는 끓는 물로 원추출하고 에틸 아세테이트로 정제하여 소나무 껍질에서 프로안토시아니딘을 얻었습니다. 추출제로 물을 선택할 경우 추출 시간이 오래 걸리고 온도가 높아 프로안토시아니딘이 쉽게 손실될 수 있습니다. 동시에 물은 극성이 더 강하고 더 많은 불순물을 용해시킵니다.

2.2 유기용매-물 추출법

포도씨 프로안토시아니딘을 추출하는 데 일반적으로 사용되는 유기용매는 메탄올, 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트입니다. 극성은 II이고 Jt 순서는 메탄올 gt, 아세톤 gt입니다. 에탄올은 가격이 저렴하고 풍부하여 일반적으로 사용되는 추출용매이다. 에틸아세테이트로 추출한 프로안토시아니딘 성분은 생물학적 활성이 좋지만 극성이 낮아 프로안토시아니딘 추출이 불완전합니다. 메탄올과 아세톤 수용액(50%~75%)은 프로안토시아니딘에 대한 추출 성능이 좋으며 프로안토시아니딘 함량 측정을 위한 추출 용매로도 자주 사용됩니다. Xiong He-21은 폴리페놀에 대한 메탄올, 에탄올 및 아세톤 수용액의 추출 효과를 비교한 결과 70% 아세톤 수용액이 가장 좋은 용매인 것으로 나타났습니다. 아세톤 수용액의 추출 효과가 좋은 이유: 프로안토시아니딘 분자는 여러 개의 벤젠 고리와 에테르 결합을 포함하고 유용성이 높으며 분자 골격에 연결된 수산기가 많으며 물에 대한 용해도가 좋습니다. 아세톤이 서로 일치하면 프로안토시아니딘의 용해도가 자연스럽게 증가하고 그에 따라 추출 속도가 향상됩니다.

2-3 기기 보조 추출 방법

포도씨 프로안토시아니딘 추출에 초임계 추출과 초음파 보조 추출이 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 초임계 CO: 추출율이 높고 프로안토시아니딘은 공기와 빛의 영향을 받지 않습니다. 그러나 고가의 장비로 인해 활용이 어렵습니다. 초음파 방식은 초음파에 의해 생성되는 강한 진동, 높은 가속도, 강한 캐비테이션 효과, 교반 및 기타 특수 효과로 인해 식물의 세포벽을 파괴하여 용매가 세포 안으로 침투하여 화학 성분을 용해시킬 수 있습니다. 용매에 첨가함으로써 추출 효율을 향상시킵니다. 프로안토시아니딘 등 열에 민감한 물질을 추출하는데 탁월한 성능을 보입니다.

3 포도씨 프로안토시아니딘 검출

포도씨와 포도씨 추출물에 함유된 대부분의 폴리페놀은 프로안토시아니딘(일반적으로 70% ~ 85%), 많은 제조업체에서는 활성 성분의 함량을 보정하기 위해 프로안토시아니딘을 사용합니다. 프로안토시아니딘 함량은 포도씨 추출물 또는 포도씨의 품질을 반영하는 주요 지표로, 프로안토시아니딘 값과 프로안토시아니딘 함량이라는 두 가지 주요 지표가 있습니다.

3.1 프로안토시아니딘 값의 결정

프로안토시아니딘 값을 결정하기 위해 Bates-smith 방법과 Poaer 방법을 사용했습니다. 원리: 프로시아니딘은 산성 조건에서 가열되어 적색 안토시아닌으로 전환되는 반면, 카테킨 및 에피카테킨과 같은 플라반-3-올 단량체는 이러한 반응을 일으키지 않습니다(그림 2). 이들이 측정한 결과는 각각 프로안토시아니딘 지수와 PVU로 표현되는 프로안토시아니딘의 상대적 함량으로, 이는 실험식을 바탕으로 구해졌다. 포도씨 추출물의 프로안토시아니딘 지수는 일반적으로 80~100이고, PVU는 일반적으로 250~350입니다.

프로안토시아니딘 값은 상대적인 함량일 뿐 프로안토시아니딘의 실제 함량은 아닙니다. 조사에 따르면 프로안토시아니딘 값이 95인 제품은 폴리페놀 함량이 15% 정도 차이가 나고 품질도 확연히 다르다. 많은 제조업체들이 포도씨 추출물의 프로안토시아니딘 비율을 표시하기 위해 프로안토시아니딘 지수를 사용하는데 이는 잘못된 것입니다.

그림 2 안토시아닌 생성 반응 그림 2. 2 시안화 생성 반응

3.2 프로안토시아니딘 함량 측정

프로안토시아니딘 함량을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며 이 역시 매우 혼란스럽습니다. 다음과 같은 방법이 일반적으로 사용됩니다.

3.2.1 철염 촉매법

이 방법의 반응 원리는 프로안토시아니딘 값 측정과 동일하며 프로안토시아니딘 함량을 계산할 때 프로안토시아니딘 표준품을 사용합니다. Fe¨와 염산은 일반적으로 사용되는 촉매 및 산분해제입니다. 반응매체로 물이나 에탄올을 사용하는 경우 흡광도 값이 매우 낮기 때문에 일반적으로 반응매체로는 n-부탄올을 사용한다15-161.

일반적인 특정 작업: 10 mL 눈금 시험관에 1.0 mL 시료 용액(또는 프로안토시아니딘 용액)을 넣고 n-부탄올 농축 염산(95:5) 6.0 mL와 2% 황산암모늄철 용액(2 mol/L에 용해)을 첨가합니다. L 염산) 0.2mL를 잘 섞어 끓는 수욕에 넣어 40분간 가열한 후 즉시 꺼내어 얼음물을 넣어 급히 상온으로 식힌 후 550Nm에서 흡광도를 측정한다.

이 방법은 더 간단하고 프로안토시아니딘에 대해 더 나은 선택적 반응을 보입니다. 철염 촉매화 방법은 반응 시스템의 수분 함량과 Fe 농도에 대한 엄격한 요구 사항을 가지고 있으며 일반적으로 수분 함량은 6%이고 Fe 농도는 4.5x10%입니다. 또한 과도한 Fe¨ 농도는 반응에 영향을 미치지 않습니다. . Fu Wusheng l61 연구에 따르면 3%~4%가 적절한 수분 함량이고 Fe 농도는 9로 선택됩니다. 약 Ox10%. 그러나 일부 학자들은 2%~6%의 수분 함량이 안토시아닌 형성을 억제하는 효과가 있으며, 약간 더 높은 Fe 농도(15g/L)도 안토시아닌 형성을 억제한다는 결론을 내렸습니다.

철염의 촉매반응을 바탕으로 양다진 l I 등은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로안토시아니딘의 함량을 검출했습니다. 이 방법에서는 위에서 언급한 철염 촉매 조건 하에서 프로안토시아니딘에 의해 생성된 진한 빨간색 안토시아닌 이온을 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하여 프로안토시아니딘의 함량을 결정합니다. 이 방법은 일부 불순물의 영향을 제거할 수 있으며 정확한 정성 및 정량 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.

3.2.2 바닐린 방법

측정 원리: 프로안토시아니딘과 카테킨 단량체의 A 고리는 산성 조건에서 A 고리에 있는 플로로퀴놀 또는 플로로글루시놀이 바닐린과 축합합니다. , 생성물은 농축된 산의 작용으로 적색 탄소 이온을 형성합니다. 샘플의 농도는 생성된 색상과 양의 상관 관계가 있습니다. 흡수 광 값은 500lm l91의 파장에서 측정됩니다(그림 3).

그림 3 페놀축합반응

바닐린법을 측정할 때 일반적으로 카테킨을 표준물질로, 메탄올을 용매로 사용합니다. 염산과 황산 모두 반응 과정에서 촉매로 사용할 수 있지만 황산을 사용할 때는 농도가 너무 높으면 바닐린이 자기 응축 반응과 산화 분해를 쉽게 일으킬 수 있습니다. 구체적인 조작 방법은 다음과 같습니다: 1 mL 시험 용액 2.5 mL 1% 바닐린 메탄올 용액 2.5 mL 25% 황산 또는 8% 염산 (둘 다 메탄올에 용해됨), 30. 15분~20분2l 동안 2회 반응합니다. 1mL의 시험 용액 6mL의 4% 바닐린 메탄올 용액 3mL의 진한 염산, 실온에서 15분 동안 반응231; 일부는 20°C에서 15시간 동안 반응하기도 합니다. 작동 방법이 상당히 다르기 때문에 사용자의 선택에 도움이 되지 않으며 통일이 필요합니다.

3.2_3 자외선 분광광도법

프로안토시아니딘은 가시광선 영역에서 특징적인 흡수 피크가 없고 자외선 영역에서 독특한 흡수 피크를 갖는 무색 물질이며 최대 흡수 파장은 280Nm입니다. . 에. 이 방법은 간단하고 빠르지만 프로안토시아니딘 함량의 순도가 특히 높은 제품에만 적합하며 일반 원료의 프로안토시아니딘을 검출하는 데는 적합하지 않습니다. 이는 카테킨도 280Nm, V, Vc, Ve에서 최대 흡수를 갖기 때문입니다. , Ve, 루틴, B-카로틴 및 기타 물질은 이 파장에서 명백한 흡수를 보입니다.

3.2.4 Folin-Ciocaheau와 HPLC 조합 방법

이 방법은 에서 권장하는 방법입니다. 미국 포도씨 방법 평가위원회. Folin-Ciocaheau 방법은 일반적으로 갈산을 대조 물질로 사용하여 폴리페놀 함량을 측정합니다. 알칼리성 용액에서 폴리페놀은 텅스토몰리브덴산을 환원시켜 760Nm에서 최대 흡수를 갖는 파란색 화합물을 형성할 수 있습니다. 포도씨 추출물의 폴리페놀 함량은 일반적으로 75%~95%입니다. HPLC를 이용하여 갈산, 카테킨, 에피카테킨, 에피카테킨 갈레이트 4가지 단량체의 함량을 측정하여 총 단량체량을 나타내었습니다. 이는 이 4가지 단량체의 함량이 포도씨 추출물의 단량체 함량의 90.0% 이상을 차지하기 때문이다. 프로안토시아니딘 함량은 폴리페놀 함량과 모노머 함량의 차이입니다.

이 방법의 단점은 단백질, 아미노산, 핵산, 아스코르빈산 등 쉽게 산화되는 물질도 폴린-시오칼토 반응에 참여한다는 점이다. 동시에, 포도씨 추출물 중 갈산의 함량은 매우 적기 때문에(0%~1.2%), 카테킨(1.5%~7.3%) 및 에피카테킨(2.0%~5.0%)과는 다릅니다. ) 함량은 매우 다양하며, 갈산의 양으로 표현되는 프로안토시아니딘의 함량은 대표성이 없습니다.

3.2.5 암모늄 몰리브덴산염 분광광도법

약산성 매질에서 카테콜과 암모늄 몰리브덴산염 사이에 노란색 몰리브덴산염 에스테르가 형성되는 것을 기반으로 합니다. 반응 생성물은 다음에서 최대 흡수를 갖습니다. 333nm의 파장. Ma Yajun은 인치 검출 조건을 간단하게 조사했습니다. 0.08mol, 1mL의 몰리브덴산 암모늄 용액을 취하여 25mL 비색관에 넣고 적당량의 시험 용액을 첨가한 후 1을 사용합니다. OxlO mol/L 염산이 표시에 도달하고 반응이 즉시 완료됩니다.

반응 원리에 따르면 안토시아닌, 갈산, 카테킨은 모두 카테콜 구조를 갖고 있으며 몰리브덴산염 에스테르 생성에도 관여한다. 프로안토시아니딘 측정의 선택성은 높지 않고 불순물의 영향을 크게 받는다. .

3.2.6 기타 측정 방법

Ma Yajun은 프로안토시아니딘 함량 측정 방법을 연구했습니다. 철염-페리시안화칼륨 분광광도법은 프로안토시아니딘이 Fe로 환원되는 능력에 기초합니다. Fe, Fe 및 페리시안화칼륨은 710 nm에서 최대 흡수를 보이는 가용성 진한 파란색 배위 화합물을 형성합니다. 이는 강산성 매질에서 프로안토시아니딘과 Ce의 반응을 기반으로 하는 황산세륨암모늄 분광광도법의 원리에 따라 무색 Ce가 생성됩니다. Ce"는 319nm의 파장에서 최대 흡수를 나타냅니다. 노란색의 고세륨염의 흡광도를 측정하여 프로안토시아니딘을 간접적으로 측정합니다. 유동 주입 억제 화학발광 방법도 있습니다[271: 알칼리성 조건에서 H:O를 감소시키기 위해 프로안토시아니딘을 사용하면 루미놀-H20 시스템의 화학발광을 억제할 수 있으며 억제 정도는 농도와 선형적으로 관련됩니다. 프로안토시아니딘. 이 세 가지 방법은 폴리페놀의 환원 특성을 사용하여 폴리페놀 함량을 결정하는 Folin-Ciocaheau 방법과 유사합니다. 결과적으로 프로안토시아니딘의 함량이 증가합니다.

요컨대, 프로안토시아니딘 값의 측정은 프로안토시아니딘의 실제 함량이 아닌 경험식에 기초할 뿐이며 현대 검출 방법으로는 시대에 뒤떨어진 것입니다. 프로안토시아니딘 측정을 위한 철염 촉매 방법은 매우 구체적이고 응용 전망이 좋지만 여전히 추가 연구와 개선이 필요합니다. 바닐린법은 프로안토시아니딘과 플라반-3-올 단량체의 총량을 측정하며, 플라반-3-올 단량체인 카테킨과 에피카테킨의 함량을 검출하는 HPLC 방법을 결합하여 프로안토시아니딘의 함량을 계산할 수 있습니다. 그러나 바닐린법은 수술방법이 많아 사용자의 선택에 도움이 되지 않으며, 구체적인 수술방법도 통일될 필요가 있다. 일부 외국 학자들은 프로안토시아니딘을 분석하고 검출하기 위해 HPLC/MS 기술을 사용합니다. 공정이 복잡하고 기술 요구 사항이 높아 프로안토시아니딘 제품을 결정하는 데 널리 사용할 수 없습니다.

4 전망

포도씨 프로안토시아니딘은 항노화, 항심혈관계 질환, 항암 기능 외에도 항방사선, 항피로 효과도 있습니다. , 향상된 기억력 효과로 비교할 수 없을 만큼 뛰어난 생물학적 활성과 안전성을 보여줍니다. 현재 우리나라에는 포도씨 추출물을 생산, 판매하는 회사가 50개가 넘고 연간 생산 능력이 80톤 이상입니다. 따라서 포도씨 추출물 산업의 급속한 발전에 적응하기 위해서는 기업의 생산 및 무역을 촉진하기 위해 포도씨 및 그 제품의 프로안토시아니딘 함량에 대한 통일된 측정 방법을 확립하는 것이 시급합니다. , 제품 품질 관리 및 고객 소비 지침.