1) 젤 이동이나 전기 영동도 실험이란 무엇입니까?
젤 이동 또는 전기 수영 이동 실험 (EMSA) 은 DNA 결합 단백질과 관련 DNA 결합 서열 간의 상호 작용을 연구하는 기술로 정성 및 정량 분석에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 원래 DNA 결합 단백질을 연구하는 데 사용되었으며, 현재 RNA 결합 단백질과 특정 RNA 서열의 상호 작용을 연구하는 데 사용되고 있다.
일반적으로 순화된 단백질, 세포조 추출물, 32P 동위원소로 표시된 DNA 또는 RNA 프로브를 함께 부화시켜 트랜스젠더 폴리아크릴 젤전기 영동에서 복합물과 결합되지 않은 프로브를 분리한다. DNA 복합물이나 RNA 복합물은 결합되지 않은 프로브보다 더 느리게 움직입니다. 연구 중인 결합 단백질에 따르면 동위원소 표기 프로브는 이중 체인 또는 단일 체인일 수 있습니다. DNA 결합 단백질 (예: 전사 조절 인자) 을 검출할 때 순화된 단백질, 부분적으로 순화된 단백질 또는 세포핵 추출물을 사용할 수 있다. RNA 결합 단백질을 검출할 때 과녁 RNA 결합 단백질의 위치에 따라 순화 또는 부분적으로 정제된 단백질이나 세포핵 또는 세포질 세포 추출물을 사용할 수 있다. 경쟁 실험에서 DNA 또는 RNA 단편과 단백질 결합 서열이 포함된 과뉴클레오티드 조각 (특이성) 및 기타 관련이 없는 조각 (비특이성) 은 DNA 또는 RNA 결합 단백질의 특이성을 결정하는 데 사용됩니다. 경쟁 특이성과 비특이적 조각이 존재하는 경우, 이성 결합은 복합물의 특징과 강도에 따라 결정된다.
2) 그러한 실험에 필요한 시약?
겔 이동 실험에 필요한 결합 단백질은 순화 또는 부분적으로 정제된 단백질이나 굵은 세포핵과 세포질 추출물에서 유래할 수 있다. 동위 원소 표지 된 DNA 또는 RNA 도 제조해야합니다. 일반적으로 DNA 뉴클레오티드 프로브는 g-32P 와 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표기되고 동위원소로 표시된 RNA 는 파지 RNA 중합효소와 동위원소로 표시된 뉴클레오티드로 체외에서 합성된다. Promega 의 리보스 프로브? /sup 시스템 (a, b) (카탈로그 번호 P 1420, P 1430, P 1440, p/kloc 단백질과 동위원소 표시 프로브를 결합한 후 트랜스젠더 폴리아크릴 전기 영동에서 복합물을 분리한 다음 젤을 건조시켜 자체 현상하거나 젤을 인광 이미지와 함께 사용합니까? /sup 분석.
3) 겔 이동 실험 시스템에서 제공하는 시약?
Promega 는 DNA 결합 단백질을 검출하는 젤 마이그레이션 실험 시스템을 제공하여 이런 실험에 대한 양성 대조를 할 수 있다. 이 시스템에는 과녁 과뉴클레오티드, DNA 결합 단백질, 결합 완충액 및 과뉴클레오티드 프로브 끝 표시에 필요한 시약 등이 포함되어 있습니다. 핵심 시스템 (카탈로그 번호 E3050) 에는 재조합 AP2 단백질을 함유한 대장균 추출물 (AP2 추출물) 과 AP2 의 동원과뉴클레오티드가 포함되어 있다. AP2 추출물은 AP2 단백질을 표현하는 대장균에서 추출한 것이다. 또한 핵심 시스템에는 SP 1 동원과뉴클레오티드, 젤 이동 결합 완충액 (5'), 20 개 비교 실험에 사용할 수 있는 HeLa 핵 추출물이 포함되어 있습니다. 전체 시스템 (카탈로그 번호 E3300) 에는 AP 1, OCT 1, CREB, NF-kB, TFIID 의 결합점 소스 시퀀스인 5 개의 다른 이중 체인 과뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 이 과뉴클레오티드는 말단 표시 후 특이성 프로브로 사용하거나 경쟁 실험에서 비특이성 프로브로 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 젤 마이그레이션 실험 기술 설명서 TB 1 10 을 참조하십시오.
4) 겔 이동 실험의 성공에 최적화해야 할 요소는 무엇입니까?
젤 마이그레이션 실험은 이론적으로 간단하고 빠르지만, 젤 마이그레이션 실험에 성공하려면 결합 단백질 소스와 프로브 결합 사이트 특성의 영향을 받는 매개변수를 최적화해야 합니다. 추출액의 제비 (핵산효소와 인산효소 오염으로 프로브가 분해될 수 있음), 결합단백질 농도, 프로브 농도, 비특이적 프로브 농도, 완충액의 레시피 및 pH, 폴리아크릴 젤 전기 영동의 특성 및 전기 수영 조건, 부화 시간 및 온도, 캐리어 단백질, 아연, 카드뮴 등 금속이온과 같은 보조 요인이 있는지 여부 등을 최적화해야 합니다. 간단히 말해서, 총 반응 부피는 최소 (20ul) 여야 합니다. 일반 요구 사항을 충족하기 위해 결합 버퍼에는 4% 글리세롤, 1mmgcl2, 0.5mm EDTA, 0.5mm DTT, 50mm NaCl,10mm tris-HCl 이 포함되어 있습니다 DI:dC 또는 10mm Hepes (pH 7.9), 50mmkcl, 1mm DTT, 1mm EDTA DI:dC 는 최적화 실험의 시작으로 사용될 수 있습니다. 자세한 내용은 젤 마이그레이션 실험 기술 설명서 TB 1 10 을 참조하십시오.
5) 어떤 동원다뉴클레오티드 프라이머가 제공되었으며, 이 프라이머의 서열 출처는 무엇입니까?
DsDNA 프로브는 다양한 전사 조절 인자의 동원결합 부위를 포함하는 종류가 다양하다. 다음 표에는 사용 가능한 프로브와 이러한 프라이머 시퀀스의 소스가 나와 있습니다.
전사 조절 인자 프로브
--
프로브 이름 카탈로그 번호 시퀀스 (권선) 시퀀스의 소스
Sp 1e323 1, e32325'-att CGA tcggggggggcg-3' SV40 프로모터 (1)
Ap1e3201e32025'-cgcttgatcagcgaa-3' 콜라게나 제 유전자 TRE(2)
Ap2e3211e32125'-gat CGA act 광저우 CGCC CCG CCG GT-3' 인금속황단백질 II a(3
유전자 NF-KB E329 1, E3292, 5'-AGT TGGGGAC TTT CCC AGG C-3' 마우스 Igk 경쇄 유전자 (4)
Oct1e3241e32425'-TGT CGA ATG CAA ATC act aga a-3' ig 중쇄 유전자 (5)
Creb e3281e32825'-agag at tgc ctg ACG TCA GAC AGC tag-3' 쥐 성장 호르몬 억제 유전자 (6)
TFI ID E3221E3222 5'-GCAGCAG CAT ATA AGG Taga-3' Belta-1글로불린 프로모터.
상위 체인 시퀀스만 나열되고 프로브는 이중 체인이고 하위 체인 시퀀스는 상위 체인 시퀀스와 쌍을 이룹니다. 굵은체는 시퀀스가 특정 유전자 서열 (transcription adjustment factor) 에서 유래되었음을 나타내며, 전사 조절 인자로 결합된 시퀀스는 아래 선으로 표시됩니다. 일반적으로 주변의 뉴클레오티드는 임의적이다.
DNA 프로브의 선택은 어떤 중요한 요인을 고려해야 합니까?
결합되지 않은 프로브와 단백질 DNA 복합체의 전기 영동분리를 용이하게 하려면 대상 DNA 의 길이가 300bp 미만이어야 합니다. 쌍사슬 합성 과뉴클레오티드와 제한 효소 조각은 젤 이동 실험에서 프로브로 사용될 수 있다. 과녁 단백질이 확인되면 짧은 과뉴클레오티드 조각 (약 25bp) 을 사용하여 결합점을 다른 계수의 결합점과 구분할 수 있습니다. 긴 제한 조각은 추정된 하위/향상된 하위 영역에서 단백질 결합 지점을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 DNaseI 각인은 DNA 서열 수준에서 단백질 결합의 특정 영역을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
7) AP 1, AP2, CREB, tfiid, oct 1, sp 1
HeLa 핵 추출물이 결합단백질의 원천으로 사용될 때, 각 1 개 전사 조절인자는 관련 DNA 동원서열과 결합하여 특징적인 결합형태를 형성한다. 다음은 각 전사 조절 인자에 대해 설명합니다. 여기에는 공인된 동원서열, 계수의 크기, 특이성 결합 조건, HeLa 핵 추출물과 형성될 수 있는 복합물의 수가 포함됩니다.
1.ap 1: AP 1 (활성화 단백질 1) 은 상 동성 서열이 5'-TGA gtts 인 전사 조절기입니다 AP 1 의 결합 지점이 유전자의 하위 영역에 존재할 때, 예를 들어 단백질 키나아제 C (2 2,7) 와 같은 유전자는 포포에스테르에 의해 유도될 수 있다. 세포에서 AP 1 c-Jun 또는 Jun 관련 단백질을 형성하는 동이합체 또는 c-Jun 또는 JUN 관련 단백질과 c-Fos 또는 Fos 관련 항원 (Fras) 을 형성하는 이합체입니다. Fos 단백질 자체는 동형 이합체를 형성할 수 없으며 AP 1 결합점과 단독으로 결합할 수 없습니다. C-Jun 단백질은 40kDa 의 단량체 단백질로 류신 지퍼를 통해 동형 이합체를 형성한다. 헬라 세포에서 AP 1 의 주요 형태는 c-Jun 단백질의 동형 이합체이다. 겔 이동 실험에서 특정 복합물이 형성되었다. AP 1 의 활성을 겔 이동 실험으로 결정할 때 기본 용액 성분 외에 0.0 1mg/ml 중합 (dI:dC)? Di: DC) 결합 버퍼에 100 ug BSA 및 5 mm DTT 를 추가합니다. 순화된 단백질을 사용하는 경우 1-2ug 단백질을 사용하여 이동 복합물을 검출한다.
2.AP2: AP2 는 TPA- 및 cAMP- 유도 계수 (10) 로 각각 사용할 수 있는 전사 조정 계수입니다. 그것은 52 kDa 의 단백질로, 공인된 동원서열은 5'-CCCGGC-3' 또는 5'-GCCNNGGC-3' (3) 이다. 이런 요인은 황산에 특히 민감하며 형태 발생에서 중요한 역할을 할 수 있다. HeLa 핵 추출물은 AP2 동원DNA 프로브와 특이성 복합물을 형성한다. 정제된 단백질이 젤 이동 실험에 사용될 때 20-50ng 의 단백질을 사용한다.
3.CREB: CREB 는 cAMP 에 응답하는 5'-t(g/t)ACG TCA-3'DNA(6,1/kloc 를 식별하는 37 kDa 전사 조절기입니다 류신 지퍼 구조를 포함하여 동형 이합체를 형성하고, 관련 기본 도메인은 c-JunDNA 결합 도메인과 동족한다. HeLa 핵 추출물을 사용할 때, 그것은 CREB 동족서열과 복합물을 형성할 수 있다.
4.NF-KB: NF-KB 는 처음에 B 세포의 면역 글로불린 K 경쇄의 증자와의 결합으로 확인되었다. 그러나 나중에 비 B 세포의 세포질에서 NF-kB 와 IkB 의 복합물을 형성한 것으로 밝혀졌다. 원래 DNA 결합 단백질 복합물에서 분리된 NF-kB 는 p65(RelA) 와 p50 으로 구성된 이합체입니다. 기타 분리된 단량체는 p49 (p52 라고도 함), p75 (c-rel) 및 p68 (relb) 입니다. 단체 p65, p68 및 p75 는 역활성화 작용을 합니다. P50 과 p49(p52) 단량체는 DNA 결합 활성을 가지고 있지만 소량의 역활성화만 가능합니다. 보도에 따르면 p49 와 NF-kB 단량체 p65 는 p50/ p65 이원 쌍체인체와 비슷한 전사 활성을 가진 이원 쌍체인체를 형성한 것으로 알려졌다. P49/ p65 와 p50/ p65 이합체는 세포질에서 IkBa/MAD-3 이라는 억제제로 조절된다. IkB 와 p65 단량체의 결합은 핵에서의 위치와 DNA 의 결합을 막는다. 체외에서 고농도의 p65 는 DNA 약과 결합될 수 있는 동형 이합체를 형성할 수 있다. 중합 (dI:dC) 은 이런 반응을 억제할 수 있다 (14). P49 와 p50 도 동원이합체를 형성할 수 있지만 세포에서의 농도는 매우 낮다. 보통 NF-kB 의 젤 마이그레이션 실험에서 20ul 의 반응부피에는 0.28 피무어의 NF-kB9 과뉴클레오티드 (pH 7.9), 50 mm MKCl, 0.2 mm EDTA, 2.5 mm DTT, 65,438+00 이 있다. 순화단백질을 사용할 때 250-300ng 는 젤 이동 복합물을 형성하기에 충분하며 10ug 의 HeLa 핵 추출물이 필요합니다. 젤 이동 복합물은 실온에서 30 분 동안 부화하고, 젤 이동 복합물은 7% 폴리아크릴 젤전기 영동에서 50mMTris(pH8.3) 와 38mM 글리신으로 분리된다. 코마스블루와 크실렌 블루틴을 함유한 샘플 용액은 여성대조군반응에만 첨가할 수 있다. 이 두 색소는 NF-kB 복합물의 해체를 악화시킬 수 있기 때문이다. HeLa 핵 추출물이 단백질 결합원으로 사용될 때, p50/p50, 이합체, p50/ p65 이합체라는 두 가지 서열 특이성 젤 이동 복합물을 형성할 수 있다. P49, p50, p65 를 표현하는 세포에서 네 가지 서열 특이성 젤 마이그레이션 복합체 (p49/P49, p50/P50, P50/p65, p49/ p65) 를 감지할 수 있습니다. 고농도의 P65 가 있다면 소량의 p65/p65 를 감지할 수 있습니다. MM GTP, ATP, 정아민, 아정아민, 바륨 또는 칼슘 이온, ng Co+3(NH3)6( 12) 과 같은 시약 중 하나를 체외에서 NF-kB 의 결합을 강화할 수 있습니다.
5.OCT 1: OCT 1 은 OCT 전사 조절자 가족의 일원으로 포유류 세포에 광범위하게 존재한다 (5). POU 도메인에는 POU 상자와 상 동성 도메인이 포함됩니다. HeLa 핵 추출물을 사용할 때 OCT 1 동원탐침에 의해 형성된 시퀀스 동족젤 마이그레이션 복합물을 감지할 수 있습니다.
6.Sp 1: Sp 1 은 10 뉴클레오티드의 상 동성 시퀀스 5'-GGGGGGGGGGGGGGG C 를 식별하는 O- 당화 전사 조절 계수입니다. 코어 인식 시퀀스는 5'-ggggggg-3' 입니다. 코어 시퀀스와 유사한 시퀀스는 일반적으로 프로모터에 존재합니다. 한 가지 예는 SV40 의 초기 프로모터로, SP 1 과 결합할 수 있는 첫 번째 프로모터입니다. 당분화에 따라 분자량은 95- 105kDa 이고 DNA 결합 도메인의 아연 지문 3 개가 시퀀스의 특이성을 결정합니다. HeLa 핵 추출물은 SP 1 동원탐침과 특이성 젤 이동 복합물을 형성한다.
7.tfiid/TFIIB: tfiid 와 TFIIB 는 RNA 중합 효소 II 프로모터 (16) 의 기본 전사에 참여하는 기본 전사 조절자입니다. TFIID 와 진핵 시동자의 타타 영역은 특이성 DNA 결합을 형성한다. TFIID 는 TATA 도메인 결합 단백질 (TBP) 이 TATA 시퀀스의 결합에 참여하는 여러 단백질로 구성됩니다. TFIID 의 다른 단백질 성분을 TBP 관련 계수 (TAFs) 라고 합니다. TFID 탐침 과뉴클레오티드와 헬라 핵 추출물로 약한 젤 이동대를 얻을 수 있지만 TFID 서열 특이성 젤 이동 복합물로 확인하기는 어렵다. 순화된 재조합 TBP 는 젤 이동 실험을 하기 어렵다. 일부 TBP 가 강한 양전하를 띠고 있어 TBP/DNA 복합물이 젤에 들어가기가 어렵기 때문이다. 순화된 TBP 는 이합체를 형성한 후 DNA( 17) 와 결합할 수 없다. 따라서 형성된 이량 체는 DNA 결합에 참여할 수 있다. TFIIB 는 DNA 와 별도로 결합되지는 않지만 TFIID 와 결합되면 DNA 와의 결합이 향상됩니다.
TFIIB 가 전면 시동 복합물과 결합된 후 RNA 중합 효소 II 및 TFIIF 는 전사 시작 영역과 결합됩니다. 따라서 TFIIB 는 시작 전 복합체의 형성에서 중요한 역할을 한다. 정제된 TFIID 가 젤 마이그레이션 실험에 사용될 때 결합 반응에 집합 (dI-dC) 을 추가할 필요가 없습니다. 결합 버퍼액에는 10% 글리세린, 20 mm tris (pH 8.0), 10 mm MgCl2, 2 mm DTT 및 89 mm KCl 이 포함되어 있습니다. 집합 (dG:dC) 은 TFIID 의 젤 결합 실험에 추가될 수 있습니다. DG:dC. 형성된 복합물은 트랜스젠더 폴리아크릴 겔 전기 영동으로 분리되며 겔 성분은 0.5'TBE, 6% 폴리아크릴 젤 (19: 1 아크릴: 이분법), 입니다 TFIID 와 TFIIB 가 포함된 복합물을 연구할 때는 결합 완충액, 젤, 전기 수영 버퍼액에서 MgCl2 를 제거해야 합니다. 이것들은 일반적인 요구 사항입니다. 서로 다른 세포 추출물, TFIID 및 TFIIB 형성 복합물을 사용하여 젤 마이그레이션 실험을 할 때는 여러 가지 요소를 최적화하여 원하는 조건을 달성해야 한다.
8) 젤 마이그레이션 실험에 얼마나 많은 단백질이나 추출물과 표기된 DNA 프로브를 사용합니까?
각 특이성 결합 단백질과 프로브에 대해 사용되는 순화 단백질, 부분 순화 단백질, 조핵 추출물을 최적화해야 한다. 일반 순화단백질의 사용량은 20 ~ 2000NG 사이이며, 단백질과 DNA 의 등몰비는 DNA 의 5 배로 조절할 수 있다. 굵은 핵 추출물의 경우 1-20ug 단백질이 있어야 특이성 복합물을 형성할 수 있다. 반응으로 추가된 프로브의 양은 50,000-200,000cpm 32p 마커 프로브 (높은 비율 활성) 이며 반응 부피는 65,438+0-5ul 입니다. 이것은 10-50 밀리무어의 DNA 프로브에 해당한다. 프로브는 분해를 방지하기 위해-20 C 에 저장해야 하며 합성 또는 표시 후 1-2 주 이내에 사용해야 합니다. 프로브와 결합 단백질은 모두 반복적인 동결 융해를 피해야 한다.
9) 체외 번역으로 단백질을 만들 수 있습니까?
Promega 는 모든 전사 조절 인자에 대해 이런 테스트를 하지 않았다. 일반적으로 밀 배아 추출물은 포유류 전사 인자나 DNA 결합 단백질의 체외 번역에 사용되며, 토끼 망직적혈구 분열물에는 내원성 포유동물 전사 인자나 DNA 결합 단백질이 포함될 수 있다. 하지만 TNT 는요? /sup > 토끼망직적혈구분열시스템 (A, B, C, D) 과 TM 바이오틴 마크를 뛰어넘는 tRNA (카탈로그 번호 E320 1) 를 함께 번역해 전사 조절자 AP 1(c-Jun) 을 번역한다. TNT? /sup > T7 커플 링 밀 배아 추출물 (B, C, D, E) 은 체외에서 c-Rel 을 번역한다. 이 단백질 특이성은 면역 글로불린 K 경체인 증강자의 프로브를 이동한다. 체외에서 c-Rel 결합 반응으로 번역된 MAD-3(IKB 가족 구성원) 을 추가하면 상호 작용을 방해할 수 있습니다.
10) 집계 (dI:dC)? DI:dC), 비특이적 경쟁 DNA 와 이성 경쟁 DNA 의 역할은 무엇입니까?
그것은 이노신과 시토신으로 구성되어 있다. 그 특수한 구조로 인해 단백질과 표지 프로브의 비특이적 결합을 억제하여 가짜 복합물을 피할 수 있다. 겔 이동 반응에 중합 (dI:dC) 을 넣을까요? DI:dC) 는 조핵 추출액 중 다른 DNA 결합 단백질의 결합을 억제할 수 있다. 예를 들면 전사 조절 인자의 비특이적 결합이다. 순화 단백질은 젤 이동 반응에 사용될 때 폴리 (dI:dC) 를 첨가할 필요가 없습니까? DI:dC), 추가하면 일반반응에 사용되는 최종 농도는 50- 100ng 를 초과하지 않습니다. 핵 추출물의 경우 2-3ug 핵 추출물마다 1 ug 중합 (dI:dC) 을 사용합니까? DI:dC). 형성된 복합물의 특이성을 확인하기 위해 증가하는 비방사성 특이성 경쟁 DNA 또는 비특이성 경쟁 DNA 가 있거나 없는 상태에서 결합 반응을 하는 경쟁 실험. 일반적으로 비방사성 특이성 DNA 는 표기되지 않은 DNA 프로브, 비특이적 경쟁 DNA 로 DNA 프로브와 같은 길이로 구성되지만 서열은 다르다. 비방사성 이성 DNA 와 경쟁할 수 있지만 비특이적 경쟁 DNA 와 경쟁할 수 없는 복합물은 과녁단백질과 동위원소 표시 프로브의 특이성 결합을 나타낸다. 비특이적 결합은 이성 DNA 와 비특이적 경쟁 DNA 에 의해 경쟁할 수 있다. 결합액의 중합 (dI:dC)? DI:dC) 최적화가 필요하지만 일반적으로 0.05mg/ml 을 사용합니다. 비방사성 (특이성 또는 비특이성) 경쟁 DNA 의 복용량도 최적화나 적정이 필요하지만, 경쟁 DNA 는 일반적으로 동위원소 마크 프로브의 10- 1000 배 (w/w) 입니다. 송아지 흉선 DNA 와 같은 다른 유형의 경쟁 DNA 는 젤 이동 반응에 사용할 수 없으며, 표적 단백질의 결합 부위를 운반합니다.
1 1) 단백질/프로브 복합물과 자유 프로브를 분리하는 데 사용되는 젤 조건은 무엇입니까?
단백질/프로브 복합물과 자유 프로브는 트랜스젠더 폴리아크릴 젤전기 영동에 의해 분리될 수 있습니다. 폴리아크릴의 농도는 일반적으로 6% (30: 1 아크릴아미드: 이원) 이며 특정 조건에서 고농도 또는 저농도를 사용할 수 있습니다. PH, 폴리 아크릴 아미드의 농도와 아크릴 아미드와 디 블록 아크릴 아미드의 비율은 젤에서 복합체의 이동에 영향을 미칩니다. 10- 15 볼트의 전압은 대부분의 단백질에 사용되고, 단시간 고전압 (30-35 볼트) 의 전압은 빠르게 분해되는 단백질에 사용됩니다. 전기 영동에 사용된 TBE 와 TAE 는 반드시 새로 준비한 것이어야 하며 침전이 없어야 한다. 아크릴 아미드 기질의 낮은 이온 강도와' 박스 효과' 는 복합물의 안정성에 도움이 된다. TGE 버퍼 (12.5mMTris, pH8.3 8.3,95MM 글리신, 0.5mMEDTA) 도 불안정한 단백질 /DNA 복합체에 사용할 수 있습니다. 결합과 전기 수영 실험은 불안정한 복합물과 프로브의 해체를 방지하기 위해 40 C 에서 진행될 수 있다. 샘플 용액의 색소는 불안정한 복합물의 해체를 초래할 수 있으므로 코마스 블루와 크실렌 블루가 함유되지 않은 샘플 용액을 사용해야 한다. 띠가 촘촘하지 않고 트레일러가 나타나면 화합물이 해체되는 것을 설명한다. 젤은 줄무늬 트레일러를 피하기 위해 완전히 수렴해야 한다. 복합물이 젤에 들어가지 않으면 사용된 단백질이나 프로브가 과다하거나 소금의 농도가 이 반응에 너무 높다는 것을 알 수 있다. 추출물을 함유한 시험지에는 자유탐침이나 복합물이 없고, 탐침만 함유한 시험지에는 탐침이 있어 추출물이 핵산이나 인산효소에 오염되어 있으므로 추출물과 결합반응에 해당 억제제를 첨가해야 한다. 현재 고강도 진지당 젤로 단백질/프로브 복합물을 분리할 수 있습니까? /sup/ 아가로 오스).
12) 특정 화합물에 단백질이 있는지 어떻게 확인합니까?
부분적으로 정제 된 단백질 또는 거친 핵 추출물과 특정 프로브는 하나 이상의 특정 단백질 복합체를 형성 할 수 있습니다. 다중복합물의 존재는 단백질이 분해되어 추출물을 준비하는 용액과 결합반응에 단백질효소 억제제를 넣어야 한다는 것을 보여준다. 복합물에서 단백질의 특징을 결정하기는 어려울 수 있지만, 그것을 연구할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 목표단백질에 대한 항체, 초마이그레이션 실험, 항체, 단백질/프로브 복합체의 단백질 결합, 복합물의 이동을 늦추고 초이동을 형성할 수 있다. 결합 반응에 증분 항체 추가 프로브와 반응한 후 단백질에 항체 또는 프로브를 추가하기 전에 추출물을 항체 와 결합할 수 있습니다. 항체 특정 항원에 따라 클러스터를 결정하는데, 전자는 초이동 복합물을 형성하는 데 도움이 되고, 후자는 복합물의 형성을 막아 원복합물의 강도를 떨어뜨린다. 대부분의 실험은 항체, 항체 대 단백질의 무어비 1: 1 을 적정한 다음 항체 양을 늘려야 한다. 순화된 단백질이 있을 때, 그것들은 실험의 띠 이동 복합물과 비교할 수 있다. 초이동 실험 외에도 자외교련과 마크 이동을 통해 복합물 속 단백질의 특징을 분석할 수 있다. 균일 한 마커 프로브와 핵 추출물이 부화 한 후 복합체는 자외선을 통해 가교 결합 된 다음 보호되지 않은 프로브가 DNase 를 통해 분해됩니다. DNA 가 끝에서 표시된 프로브에서 표시를 제거하기 때문에 균일하게 표시된 프로브가 필요합니다. 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 여러 보호 뉴클레오티드 가교 단백질을 분리하여 건조시키고 자체 현상한다. 결합 단백질의 분자량은 표준 분자 참조와 비교할 수 있다. 단백질 각인 분석은 과녁 단백질 항체 복합물 (20) 에서도 수행할 수 있습니다. 단백질이 DNA 프로브의 특정 서열과 결합되면 보수적 결합 서열과 돌연변이를 함유한 경쟁 과뉴클레오티드를 통해 표상할 수 있다. 고정 소수점 돌연변이는 보수 시퀀스의 결합 부위를 변경하여 복합물의 형성을 연구하는 데도 사용할 수 있습니다.
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