키워드: l9981; 유전자 칩 유전자 발현 Nm23-H 1 유전자
중국 도서관 분류 번호: r 734.2; Q8 13. 1
문서 식별자: a
품번:1007-7847 (2006) 01-0077-05.
Nm23-H 1 유전자는 종양 전이 억제 유전자로 증명되었다. Nm23-H 1 유전자의 cDNA 를 누락 된 nm23-H 1 유전자 발현의 인간 고 전이 대 세포 폐암 세포주 L998 1 으로 전환함으로써 악성 표형을 역전시킬 수 있습니다. 그러나 nm23-H 1 폐암 침범과 전이를 억제하는 분자 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 우리의 초기 연구에 따르면 nm23-H 1 유전자가 종양 침범과 전이에 대한 억제 작용을 조절하여 관련 유전자를 옮기는 것으로 나타났다. Nm23-H 1 의 분자 메커니즘을 더 연구하기 위해, 우리는 유전자 칩으로 nm23-Hl 에 대한 L99865438 의 전염을 검출했다.
1 재료 및 방법
1..1재료
L,1..1세포주
1)L998 1 (고 전이 대 세포 폐암 세포주); 2) L998 1-nm23-H 1 (nm23-H 1 유전자를 안정적으로 표현하는 L998 1 세포주/ 모두 쓰촨 화시병원 폐암 분자 중점 실험실에서 제공한다.
1..1.2 공통 시약 및 장비
정제 송아지 혈청과 RPMI t640 배양기는 Hy- clone 에서 구입했다. 1.20 mmol/L 의 NaOH 용액으로 1 mmol/L 의 비축액을 만들어 4 C 에 저장합니다. 위 첨자 TM II 리보 핵산효소 H- 역전사효소 (1 질소 촉매. 번호 18064-0 14), dATP, dGTP, dCTP, dTYPOligod(T) 프라이머 (Bioasia Synthesis 번호 PA5302 1), RNA 억제제 (Takara, Cat). 번호 D23 1 1A), Ola 고속 뉴클레오티드 탈착식 테스트 키트 (OIAGEN, Cat, 번호 28306) 유전자 기계: omnigrid/kloc-0
1..1.3 유전자 칩
프로젝트에 사용된 칩 버전 번호는 2.2 인간 cDNA 유전자 표현 스펙트럼 칩, 제품 카탈로그 번호는 SBC-R-HC- 100-22, 칩 번호는 17874,/KLOC-0 입니다.
1.2 방법
1.2. 1 에서 총 RNA 를 정제합니다
(RNeasy Mini Kit) 총 RNA 는 QIAGEN RNeasy Kit 으로 정제됩니다. 자세한 작동 원리 및 방법은 rn easy Mini protocol 0 1 을 참조하십시오.
1, 2,2 총 RNA 의 품질 검사
(Labonchip 테스트) 구체적인 절차는 인간 cD- NA 표현 스펙트럼 칩 사용자 설명서, SBC-H-HC- 100-22 를 참조하십시오. 자세한 결과는 샘플 품질 검사 보고서를 참조하십시오. 칩 랩은 Agi- lent 2 100 분석기 사용 설명서를 참조하여 젤을 준비하고 소프트웨어 프롬프트에 따라 RNA 전기 수영 작업을 수행하여 RNA 품질을 평가합니다.
1.2.3 샘플 준비
Sau3Al 로 CDNA 를 소화하고 커넥터로 연결한 후 PCR 범용 유인물로 증폭한다. PCR 산물은 PCR 산물로 테스트 키트 순수화를 정제하여 500 ng 를 꺼낸다. 실험 표기 방법은 cDNA 직접 표기법, 실험그룹 RNA (L998 1-NM23-H1) 는 cy3 형광표기, 대조군 RNA (L998/KLOC-0) 입니다 Cy3/ Cy5 마커를 넣은 프라이머 (100 LLM 01/l) 21ll (NaOH 로 처리된 대조군은 Cy5 로, As20 으로 처리
1, 2.4 교배
95 C 트랜스젠더 후, 표기 샘플을 사전 잡교 칩 어레이 표면에 추가하고, 커버 슬라이드를 덮고, 잡교 상자, 42 C 잡교 18h 에 넣는다.
1.2.5 탐지 및 분석
칩 결과는 안델렌 스캐너로 스캔하고, 스캔 해상도 10μm, PMT100% 데이터를 Ima- gene 소프트웨어로 읽습니다. 마지막으로 Genespring 으로 정규화 분석을 했는데, 최종 비율은 cy3/cy5, 즉 실험팀/대조군이었다. 차이 유전자의 필터링 기준은 (1) 비율 >: Or =2 는 유전자 인상이고 비율 = 0.5 는 유전자 인하입니다.
1.3 통계 분석
클러스터 분석 방법. Genespring 및 클러스터 분석 소프트웨어를 사용하여 클러스터 분석을 수행합니다.
결과 2 개
2. 1 세포 총 RNA 전기 영동 패턴
두 세포주 (L998 1, nm23-H 1 및 L998 1) 의 총 RNA 추출 및 정제 후 1%
2.2 유전자 칩 하이브리드 화 결과 및 분석
그런 다음 Cy5 와 Cy3 의 스캔 이미지를 완전히 겹칩니다. 결과 잡교 지도 (그림 2) 에서 빨간색 점은 낮은 표현, 녹색 점은 높은 표현, 노란색 점은 표현 수준이 변하지 않았음을 나타냅니다. 소프트웨어 분석을 통해 칩이 뒤섞인 분산형 차트를 얻었습니다 (그림 3). 각 점의 Y 축은 Cy3 잡교 신호의 상대 강도를 나타내고 X 축은 Cy5 잡교 신호의 상대 강도를 나타냅니다. 45 도 선에 있는 점 (실선으로 표시됨) 의 Cy5/Cy3 비율은 l 로 차이가 없음을 나타내고, 45 도 선에서 멀리 떨어진 점은 큰 차이를 나타내고, 두 대시 외부에 있는 점은 Cy3/Cy5 비율이 2 보다 크거나 0.5 보다 작은 점입니다.
2.3 유전자 칩 검사 결과
Nm23-H 1 유전자가 L998 1 세포로 전염되기 전후에 총 ***l792 개의 유전자가 있는데, 그 중 표현은1/KLLOC 로 증가 (상향 조정) 한다 상향 조정된 유전자 중 1038 개의 유전자 기능을 알 수 없다. 그 중 세포주기와 시들어가는 유전자 3 1, 암유전자 0, 종양억제 유전자 18, 전이관련 유전자 12, 세포인자와 전사인자 13, 그러나 알려진 유전자는 10 1 개이며, 이 중 세포주기와 시들어가는 유전자는 12 개, 암유전자와 관련된 유전자는1/KLOC-입니다.
3 토론
Nm23-H 1 유전자는 폐암 침범과 전이와 밀접한 관련이 있는 종양 전이 억제 유전자입니다. 우리의 초기 연구에 따르면 nm23-Hi 유전자 단백질과 mBNA 의 저표현, 돌연변이, 등위 유전자 결핍은 폐암의 높은 전이와 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 높은 전이 잠재력을 가진 사람 고전이 대세포 폐암 L998 1 세포에는 nm23-HI 대립유전자 복합성 결핍이 있다. L998 1 세포는 체외 복제와 침범 능력이 강하고, 누드 쥐의 자발적 폐 전이 능력은 100% 이다. Nm23-HI 유전자를 L998 1 세포주에 도입하면 악성 표형을 역전시킬 수 있다는 연구결과가 나체 쥐의 증식능력, 복제 형성능력, 공격능력, 자발성 폐 전이능력이 현저히 떨어지는 것으로 나타났다. 청화주 등은 nm23-H 1 유전자가 누락된 폐암이 특정 종양 침범 관련 분자의 이상 표현을 동반하는 것으로 밝혀졌으며, nm23-H 1 유전자는' 폐암 전이 억제 계단식' 관련 유전자의 상류 조절 유전자일 수 있으며, 종양 전이 가능성에 대한 억제 작용은 하류 유전자를 조절하는 것으로 추정된다. 그러나 nm23-HI 유전자가 폐암 악성 표형을 역전시키는 분자 메커니즘은 아직 명확하지 않다.
유전자 칩 기술은 우리가 nm23-H 1 구조와 기능 변화로 인해 폐암이 침범하고 전이되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 이상적인 기술 지원을 제공한다. 유전자 표현 스펙트럼 칩은 높은 처리량, 대규모, 고효율, 고감도의 특징을 가지고 있어 두 그룹 이상 서로 다른 출처의 mRNA 풍도의 차이를 분석할 수 있다. 잡교 신호의 비율과 통계 분석을 계산함으로써 우리는 차별적으로 표현된 유전자 정보를 얻을 수 있다.
본 실험은 종양 유전자 표현 마이크로어레이를 이용하여 nm23-H 1 유전자 형질 감염 L998 1 세포 전후 관련 유전자의 표현 변화를 분석했다. 유전자 발현 마이크로어레이의 응용은 nm23-H 1 유전자의 분자 메커니즘을 연구하는 게놈학 증거를 제공하여 이전의 단일 유전자 분리 연구의 한계를 돌파했다. 특히 외원 유전자를 이 유전자를 표현하지 않는 세포에 도입해 샘플 샘플링의 조직학적 차이를 피하고 실험 결과를 더욱 믿을 수 있고 분석하기 쉽다. 본 연구에서는14,000 개의 유전자를 함유한 SBC-R-HC- 100-22cDNA 유전자 발현 스펙트럼 칩을 사용하여 L98 1 세포에서 NM23 을 감염시켰다. 그들의 유전자 표현의 차이 정보를 비교하여 nm23-H 1 유전자 표현과 관련된 유전자를 찾는다. 본 연구에서 * * 는 1792 개의 차등 발현 유전자를 선별했다. Nm23-Hl 유전자 감염 후 총 1 156 개 유전자 중 1035 개 유전자. 유전자 발현이 하향 조정된 유전자는 642 개이다. 그 중 54 1 은 알 수 없는 유전자, 10 1 은 기능적 원인이다. 알려진 상향 및 하향 조정 유전자로는 세포주기 및 세포 사멸 유전자, 종양 유전자, 종양 억제 유전자, 전이 관련 유전자, 세포질 분열 및 전사 인자, 세포신호 및 단백질 관련 유전자, 세포외 기질, 세포골격 단백질 등이 있다. 상향 조정된 유전자 중에는 E-Cad, β-catenin, nm23, TIMP- 1, 2 등과 같은 종양 전이와 관련된 많은 유전자가 있다. , 종양 전이와 관련된 하향 조절 유전자는 주로 Ras, VEGF, PDGF-A, ERK-/, 2, c-src 등이다. 이러한 결과는 이전 연구 결과와 일치합니다.
하지만 본 연구에 따르면 nm23-H 1 유전자의 높은 표현은 특정 종양 억제 유전자의 표현을 증가시키고, 세포인자와 전사 인자의 활성을 높이고, 세포외 기질효소의 활성성을 높이며, 세포골조단백질의 합성에 영향을 줄 수 있다. 따라서 nm23-H 1 유전자는 세포의 증식능력과 복제 형성률을 억제하고, 기질금속단백효소의 활성화를 줄이고, 혈관 생성 유전자의 표현을 억제하는 등 다양한 방법으로 종양세포의 침입과 전이를 억제함으로써 종양의 침입과 전이를 억제할 수 있다고 추정할 수 있다. Nm23-Hl 유전자에 의한 L998 1 세포 악성 표형의 반전은 하류 관련 유전자의 조절을 통해 이뤄졌으며,' 폐암 전이 억제 계단식' 의 전방 조절에서 중요한 유전자와 상류 유전자다.
결론적으로, 종양의 침범과 전이는 다양한 유전자와 요인이 상호 작용하는 결과이며, 하나 또는 두 개의 핵심 유전자가 시간과 공간에서 서로 협력하여 세포의 암, 침범, 전이를 촉진한다. 따라서 종양의 침윤과 전이의 분자 메커니즘을 연구할 때, 단지 몇 개의 단일 유전자가 아니라 여러 개의 유전자도 분석해야 한다. 유전자 칩은 종양의 발생과 발전 및 유전자 간의 상호 작용을 연구하는 강력한 연구 도구를 제공한다. 본문은 원문의 전문이다. PDF 브라우저가 없는 사용자는 먼저 원문의 전문을 다운로드하여 설치해야 한다.